【摘 要】
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为寻找一种简洁高效的基因定点突变方案,利用Gibson组装技术对重叠延伸PCR法进行简化,并以克隆细胞周期蛋白依赖性激酶4基因单位点与双位点突变为例进行验证.采用与重叠延伸PCR相似的策略扩增含点突变的基因片段,同时采用双酶切制备线性质粒载体,保证质粒载体与基因片段含有一小段重叠序列作为接头.直接将基因片段与线性载体通过Gibson组装法拼接成完整质粒.经转化、筛选与检测,成功得到数个单位点与双位点目标突变体克隆,且阳性率均为100％.由于没有繁琐的多轮PCR扩增和频繁的DNA回收操作,也无需消化原始质粒
【机 构】
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湖北文理学院基础医学院,湖北襄阳441053
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为寻找一种简洁高效的基因定点突变方案,利用Gibson组装技术对重叠延伸PCR法进行简化,并以克隆细胞周期蛋白依赖性激酶4基因单位点与双位点突变为例进行验证.采用与重叠延伸PCR相似的策略扩增含点突变的基因片段,同时采用双酶切制备线性质粒载体,保证质粒载体与基因片段含有一小段重叠序列作为接头.直接将基因片段与线性载体通过Gibson组装法拼接成完整质粒.经转化、筛选与检测,成功得到数个单位点与双位点目标突变体克隆,且阳性率均为100％.由于没有繁琐的多轮PCR扩增和频繁的DNA回收操作,也无需消化原始质粒,该方案避免了很多干扰定点突变的因素,能简便、高效地克隆基因单位点与多位点突变.对比而言,该方案规避了重叠延伸PCR与滚环扩增法的主要缺陷,是一种基因定点突变的良好解决方案.
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