【摘 要】
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目的 体外观察低氧和常氧培养条件下喉癌CD133+细胞放疗后生长抑制率、克隆形成率的变化和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit, DNA
【机 构】
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解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医院,白求恩国际和平医院耳鼻咽喉头颈外科,中国科学院动物研究所生物膜和膜生物工程国家重点实验室
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目的 体外观察低氧和常氧培养条件下喉癌CD133+细胞放疗后生长抑制率、克隆形成率的变化和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)、共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxiatelangiectasia mutate,ATM)、Survivin、P53的表达,探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制.方法 体外培养人喉癌Hep-2细胞,用流式细胞仪分选出CD133+细胞,并分别在低氧和常氧条件下行无血清培养,流式细胞仪检测缺氧诱导因子-1α的表达.低氧组和常氧组分别用直线加速器给予0、5、10、15、20Gy的照射,24h后行四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测；给予10 Gy照射后12、24、36、48 h行MTT检测.行软琼脂克隆形成实验,并给予10 Gy照射,14 d后观察低氧和常氧组克隆形成率.两组细胞分别给予10 Gy照射,24h后用流式细胞仪分别检测DNA-PKcs、ATM、Survivin、P53的表达.结果 流式细胞仪分选后获得CD133+细胞纯度是92.8％,CD133+细胞常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组；在低氧和常氧条件下,CD133+细胞放疗后生长抑制率随放疗剂量的增加而增加,而10 Gy放疗后各个时间点细胞生长抑制率变化不大,24h时差异最大,具有统计学意义(t=6.12,P均＜0.05).软琼脂克隆形成实验显示CD133+细胞克隆形成率明显高于CD133-的对照组(P＜0.01),CD133+细胞低氧组的克隆形成率明显高于常氧组(P＜0.05).放疗前后低氧组克隆形成率变化不明显,而常氧组放疗后克隆形成率较放疗前低(P＜0.05).CD133+细胞的DNA-PKcs、ATM、Survivin和P53的表达均高于CD133-细胞(P＜0.01).放疗后两组细胞各种蛋白表达均高于放疗前(P＜0.01),低氧组放疗后DNA-PKcs、Survivin表达均较常氧组高(P＜0.05),而ATM、P53表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用,多种通路参与了喉癌干细胞放射损伤的修复.
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