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摘要： 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对20个产地的栀子种子进行酯酶（EST）、过氧化物酶（POD）同工酶测定和谱带分析，用Ntsys 2 10软件计算遗传相似性系数，并进行聚类分析，评价不同种源的亲缘关系。结果发现，20个产地的栀子种子在2个同工酶系统中均有栀子物种的共同特征谱带，但酶带数量与活性强度有差异，酯酶同工酶共出现9个谱带类型，Rf值范围0 64～0 90，其中Rf值0 67、0 71、0 73为3条特征谱带；过氧化物酶同工酶共出现5个谱带类型，Rf值范围0 70～0 77，其中Rf值0 70为特征谱带；酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶图谱能大致反映不同种源之间的遗传相似度，不同产地的栀子遗传相似度在0 50～1 00之间。酯酶同工酶和过氧化物同工酶图谱带能有效地鉴定出种子真实性，并能大致区分栀子种子的来源。
关键词： 栀子；种子；同工酶；真实性；聚类分析
中图分类号： R282 5 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0244-03
栀子为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的成熟果实，入心、肝、肺、胃经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效，内服用于热病心烦、黄疽尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡，外治扭挫伤痛 [1]。主要含环烯醚萜类、西红花苷类、黄酮类等成分，是卫生部颁布的第1批药食两用资源。栀子还有很多其他用途，栀子是古代应用广泛的黄色染料，现代还用于提取工业染料和食用色素。国内外对于栀子的需求量很大，且不断上升，具有很好的市场前景，野生的栀子资源已经难以满足市场需求，只能靠人工栽培来解决这一问题。但栀子种子混杂现象严重，不同产地的种子良莠不齐，不利于大面积的栽培繁殖。
同工酶是生物体代谢的调节者，与生理功能和细胞分化相联系，而且同工酶的发生与基因进化及种的演变有关。它不仅是生理指标，也是可靠的遗传指标 [2]。根据同工酶谱的变化，可以用来鉴别生物类别及其亲缘关系 [3]。尽管可用来分析的同工酶有百余种，但过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）是2种最常被用来分析的同工酶 [4]。本研究通过分析栀子种子过氧化物酶、酯酶同工酶谱带的多样性来评价种群间的遗传差异，为种质资源的保障提供可靠的参考依据。同时通过确立栀子种子同工酶特征谱带，为种子真实性鉴定、药材品种鉴别和资源的合理利用提供依据。
1 材料与方法
1 1 材料
样品为2013年11—12月采自湖南省、江西省、湖北省、浙江省、广西壮族自治区、重庆市、四川省等20个地区野生或栽培居群栀子的种子，具体来源和编号见表1。将已经除去外果皮和果肉的种子漂洗干净，选取健康饱满的种子放在密封袋里保存。
1 2 方法
1 2 1 酶液制备
取不同产地栀子干种子0 5 g，加入2 mL提取液（1 mol/L Tris-HCl，pH值6 8），冰浴研磨匀浆，12 000 r/min 条件下离心10 min 2次。上清液即为酶提取液，用于同工酶分析。加入等体积的40%蔗糖溶液、0 1%溴酚蓝25 μL，-20 ℃冰箱保存、备用，使用时于4 ℃下溶解。
1 2 2 电泳
采用电泳仪（天能EDS300型）和DYCZ-30B型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）进行垂直平板不连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离同工酶，胶板厚度为 1 5 mm。分离胶缓冲液为1 5 mol/L Tris-HCl，pH值8 9，酯酶同工酶采用10%的分离胶，过氧化物酶采用8%的分离胶；浓缩胶4%，缓冲液为0 5 mol/L Tris-HCl，pH值6 8。电极缓冲液为Tris-Gly系统（15 14 g的Tris加72 07 g的甘氨酸，用双蒸水定容至5 L）。在冰浴条件下，浓缩胶稳压 100 V，分离胶稳压200 V，电泳时间1 5～2 0 h，溴酚蓝至玻璃板底部0 5 cm时停止电泳。每孔上样40 μL，重复2次。
1 2 3 染色
（1）酯酶染色。称取100 mg重氨坚牢蓝溶于100 mL磷酸缓冲液（11 876 g Na2HPO4·2H2O定容于 1 000 mL 的容量瓶中，9 078 g KH2PO4定容于1 000 mL的容量瓶中，然后以3 ∶ 7的比例混合即可）。加9 mL 1 3%的乙酸-β-萘酯（用丙酮配制），6 mL 2 5%的β-醋酸萘酯（用83%丙酮配制，现用现配）。室温下染色30 min，待褐色酶带显示清晰后弃掉染色液。用7%冰乙酸固定30 min，用蒸馏水将凝胶冲洗干净后观察。（2）过氧化物酶染色。称取2 g联苯胺溶于18 mL冰乙酸，加72 mL双蒸馏水（ddH2O）配成母液，染色液取5 mL染色母液加入93 mL ddH2O，染色前加 2 mL 3%H2O2。室温下染色 30 min，显示出蓝色谱带并转变为棕色之后弃掉染色液，用水将凝胶冲洗干净后观察。
1 2 4 数据统计
染色后照相，作出酶谱图，记录酶带迁移距离，计算迁移率（Rf=酶带迁移距离/前沿指示剂距离）。根据每张同工酶图谱上的谱带分布确定带的有无，并转化成二项数据，在同一Rf处，有谱带的条带记为1，无谱带的记为0，把同工酶谱信息处理为0、1数据后，通过NTSYS 210软件，计算遗传相似系数和遗传距离，并进行聚类分析。
2 结果与分析
2 1 栀子酯酶和过氧化物酶同工酶酶谱分析
对20个不同产地的栀子种子依序进行酯酶和过氧化物酶同工酶测试。参照王中仁的方法 [5]确定9个酯酶同工酶位点，即 EST1～EST9，各位点集中在中（SF，0 33 2 2 栀子种子真实性鉴别
在酯酶和过氧化物酶同工酶的所有位点中，EST Rf值为0 67、0 71、0 73的条带，POD Rf值为0 70的条带活性强，带深、染色清晰、较稳定，染色时出现较快，分辨率高，为主酶带，可以作为种子酯酶和过氧化物酶同工酶的特征酶带，依据此特征带可以准确地鉴定种子的真实性。
2 3 种子遗传距离分析
以同工酶图谱记录数据及相似系数为测量指标，记录酶谱间遗传相似系数和遗传距离，结果见表2。从表2可以看出，各个种源间的遗传相似度在0 50～1 00之间，说明不同种源的栀子种子间有不同程度的遗传差异，但整体上栀子种子亲缘关系比较接近。采用NTSYS软件对20个不同产地的栀子种子的亲缘关系及遗传差异进行聚类分析，结果见图3。从树状图可以看出，20个种质资源可以分为5类：1、12、13、14、15、18为一类种质资源，2、4、11、16、17为一类种质资源，3、5、6、8、9、10为一类种质资源，7为一类种质资源，19、20为一类种质资源。
由图3还可以看出，某些省份之间种源的差异较明显：江西省的5个种源被分在3个不同的类群；湖北省的3个种源被分类在2个类群，且类群之间遗传距离较大；福建省宁德市福鼎市分水关的种质资源与其他产地的资源差异最明显，为单[CM（25]独的一类；浙江省的种质资源差异小，属于同一类群。此外，江西省吉安市与湖南省永州市、福建省宁德市与四川省资阳市地理位置较远，气候条件差异明显，但4号与17号样品、6号与10号样品具有相同的遗传相似度。在小范围内，6号、7号样品均产自福建省宁德市，但遗传差异显著，遗传距离很大；11号、12号均产自广西省南宁市，遗传相似度为0 79；而1号、2号与12号的遗传相似度为0 86。由此可见，栀子种子的遗传关系与地域没有必然的联系，可能由于不同产地之间最初引进的种源不同。
3 讨论
同工酶是基因编码的产物，它在电场中迁移率的改变反映了酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编码DNA上的变化，所以可通过分析同工酶酶谱的变化获得我们所需要的遗传信息 [7]。植物同工酶分析技术为估计植物群体遗传多型性、分析种内及种间差异、探讨植物起源与进化等提供了可靠的试验手段 [8]。利用过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶来研究种间的亲缘关系已经很遍，种子真实性和品种纯度代表种子的遗传品质。在本研究范围内，不同产地种子之间的酶带有共同的分布图谱，也有各自的酶谱特征，说明它们之间存在基因组的差异。
同一居群中一定种类的同工酶谱带相对稳定，所以选择一定种类的同工酶是鉴定药用植物及其原产地的适宜生化指标 [9]。本试验表明，EST、POD同工酶是栀子种子纯度鉴定宜选的酶系统，鉴定不同种源之间的遗传相似度宜选用酯酶同工酶图谱。栀子是我国大宗药材，栽培历史悠久，在引种栽培过程中，受多年的自然环境变化及不同产地之间地理、气候等诸多不同因素的影响，其遗传多样性是否遭到破坏尚不十分清楚。本研究通过对全国范围内具有代表性的20个不同产地栀子种子的酯酶与过氧化物酶同工酶酶谱进行分析，探究不同产地种源之间的遗传多样性，结果表明，不同种源之间的同工酶图谱既有栀子属的共同特征谱带，又具有各自的特征带，说明不同产地的栀子种源既具有一定的遗传稳定性，又存在各自的遗传特征。通过对栀子的过氧化物酶、酯酶同工酶酶谱分析，发现不同产区、不同栽培类型栀子的酶谱均存在一定差异，这也为揭示它们之间药性、药效、有效成分含量存在差异的原因提供一定的研究基础 。
目前栀子通过种子繁育技术大力发展人工种植栽培，而稳定的种源将是保证种子质量的前提与关键 [10]。本研究通过栀子种子酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶来探讨栀子种质遗传关系，本方法具有简便易操作、周期短、成本低等优势。种源间的亲缘关系可根据酶谱特征有效地反映出，便于鉴别种源，有利于筛选优良品种，提高药材产量和质量 [11]。
[HS2 2][HT8 5H]参考文献： [HJ1 8mm]
[1] 傅春升，娄红祥，张学顺 栀子的化学成分与药理作用[J] 国外医药：植物药分册，2004，19（4）：152-156
[2]周延清，杨清香，张改娜 生物遗传标记与应用[M] 北京：化学工业出版社，2008
[3]陈红林，陈志远，梁作侑，等 泡桐属植物同工酶分析[J] 湖北林业科技，2003（2）：1-4
[4]邹春静，盛晓峰，韩文卿，等 同工酶分析技术及其在植物研究中的应用[J] 生态学杂志，2003，22（6）：63-69
[5]王中仁 植物等位酶分析[M] 北京：科学出版社，1996：10-36
[6]易刚强，李云耀，崔培梧，等 栀子过氧化物酶、酯酶同工酶的遗传多样性分析[J] 中南药学，2012，10（6）：428-432
[7]季维智，宿 兵 遗传多样性研究的原理与方法[M] 杭州：浙江科学技术出版社，1999：71
[8]伍世平，王君健，于志熙 10种草坪及地被植物的同工酶研究[J] 武汉植物学研究，1994，12（3）：259-262
[9]张袖丽，谢中稳，陶汉之 半夏属植物同工酶的电泳分析[J] 安徽农业大学学报，1997，24（3）：291-295
[10] 方 磊，罗光明，蔡财军 等 草珊瑚种子遗传多样性的酯酶同工酶研究[J] 江西中医学院学报，2011，23（3）：42-44
[11]韩琳娜，李红梅 白花丹参和紫花丹参生化标记分析[J] 时珍国医国药，2009，20（1）：211-212
关键词： 栀子；种子；同工酶；真实性；聚类分析
中图分类号： R282 5 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0244-03
栀子为茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的成熟果实，入心、肝、肺、胃经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效，内服用于热病心烦、黄疽尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡，外治扭挫伤痛 [1]。主要含环烯醚萜类、西红花苷类、黄酮类等成分，是卫生部颁布的第1批药食两用资源。栀子还有很多其他用途，栀子是古代应用广泛的黄色染料，现代还用于提取工业染料和食用色素。国内外对于栀子的需求量很大，且不断上升，具有很好的市场前景，野生的栀子资源已经难以满足市场需求，只能靠人工栽培来解决这一问题。但栀子种子混杂现象严重，不同产地的种子良莠不齐，不利于大面积的栽培繁殖。
同工酶是生物体代谢的调节者，与生理功能和细胞分化相联系，而且同工酶的发生与基因进化及种的演变有关。它不仅是生理指标，也是可靠的遗传指标 [2]。根据同工酶谱的变化，可以用来鉴别生物类别及其亲缘关系 [3]。尽管可用来分析的同工酶有百余种，但过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）是2种最常被用来分析的同工酶 [4]。本研究通过分析栀子种子过氧化物酶、酯酶同工酶谱带的多样性来评价种群间的遗传差异，为种质资源的保障提供可靠的参考依据。同时通过确立栀子种子同工酶特征谱带，为种子真实性鉴定、药材品种鉴别和资源的合理利用提供依据。
1 材料与方法
1 1 材料
样品为2013年11—12月采自湖南省、江西省、湖北省、浙江省、广西壮族自治区、重庆市、四川省等20个地区野生或栽培居群栀子的种子，具体来源和编号见表1。将已经除去外果皮和果肉的种子漂洗干净，选取健康饱满的种子放在密封袋里保存。
1 2 方法
1 2 1 酶液制备
取不同产地栀子干种子0 5 g，加入2 mL提取液（1 mol/L Tris-HCl，pH值6 8），冰浴研磨匀浆，12 000 r/min 条件下离心10 min 2次。上清液即为酶提取液，用于同工酶分析。加入等体积的40%蔗糖溶液、0 1%溴酚蓝25 μL，-20 ℃冰箱保存、备用，使用时于4 ℃下溶解。
1 2 2 电泳
采用电泳仪（天能EDS300型）和DYCZ-30B型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）进行垂直平板不连续系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离同工酶，胶板厚度为 1 5 mm。分离胶缓冲液为1 5 mol/L Tris-HCl，pH值8 9，酯酶同工酶采用10%的分离胶，过氧化物酶采用8%的分离胶；浓缩胶4%，缓冲液为0 5 mol/L Tris-HCl，pH值6 8。电极缓冲液为Tris-Gly系统（15 14 g的Tris加72 07 g的甘氨酸，用双蒸水定容至5 L）。在冰浴条件下，浓缩胶稳压 100 V，分离胶稳压200 V，电泳时间1 5～2 0 h，溴酚蓝至玻璃板底部0 5 cm时停止电泳。每孔上样40 μL，重复2次。
1 2 3 染色
（1）酯酶染色。称取100 mg重氨坚牢蓝溶于100 mL磷酸缓冲液（11 876 g Na2HPO4·2H2O定容于 1 000 mL 的容量瓶中，9 078 g KH2PO4定容于1 000 mL的容量瓶中，然后以3 ∶ 7的比例混合即可）。加9 mL 1 3%的乙酸-β-萘酯（用丙酮配制），6 mL 2 5%的β-醋酸萘酯（用83%丙酮配制，现用现配）。室温下染色30 min，待褐色酶带显示清晰后弃掉染色液。用7%冰乙酸固定30 min，用蒸馏水将凝胶冲洗干净后观察。（2）过氧化物酶染色。称取2 g联苯胺溶于18 mL冰乙酸，加72 mL双蒸馏水（ddH2O）配成母液，染色液取5 mL染色母液加入93 mL ddH2O，染色前加 2 mL 3%H2O2。室温下染色 30 min，显示出蓝色谱带并转变为棕色之后弃掉染色液，用水将凝胶冲洗干净后观察。
1 2 4 数据统计
染色后照相，作出酶谱图，记录酶带迁移距离，计算迁移率（Rf=酶带迁移距离/前沿指示剂距离）。根据每张同工酶图谱上的谱带分布确定带的有无，并转化成二项数据，在同一Rf处，有谱带的条带记为1，无谱带的记为0，把同工酶谱信息处理为0、1数据后，通过NTSYS 210软件，计算遗传相似系数和遗传距离，并进行聚类分析。
2 结果与分析
2 1 栀子酯酶和过氧化物酶同工酶酶谱分析
对20个不同产地的栀子种子依序进行酯酶和过氧化物酶同工酶测试。参照王中仁的方法 [5]确定9个酯酶同工酶位点，即 EST1～EST9，各位点集中在中（SF，0 33
在酯酶和过氧化物酶同工酶的所有位点中，EST Rf值为0 67、0 71、0 73的条带，POD Rf值为0 70的条带活性强，带深、染色清晰、较稳定，染色时出现较快，分辨率高，为主酶带，可以作为种子酯酶和过氧化物酶同工酶的特征酶带，依据此特征带可以准确地鉴定种子的真实性。
2 3 种子遗传距离分析
以同工酶图谱记录数据及相似系数为测量指标，记录酶谱间遗传相似系数和遗传距离，结果见表2。从表2可以看出，各个种源间的遗传相似度在0 50～1 00之间，说明不同种源的栀子种子间有不同程度的遗传差异，但整体上栀子种子亲缘关系比较接近。采用NTSYS软件对20个不同产地的栀子种子的亲缘关系及遗传差异进行聚类分析，结果见图3。从树状图可以看出，20个种质资源可以分为5类：1、12、13、14、15、18为一类种质资源，2、4、11、16、17为一类种质资源，3、5、6、8、9、10为一类种质资源，7为一类种质资源，19、20为一类种质资源。
由图3还可以看出，某些省份之间种源的差异较明显：江西省的5个种源被分在3个不同的类群；湖北省的3个种源被分类在2个类群，且类群之间遗传距离较大；福建省宁德市福鼎市分水关的种质资源与其他产地的资源差异最明显，为单[CM（25]独的一类；浙江省的种质资源差异小，属于同一类群。此外，江西省吉安市与湖南省永州市、福建省宁德市与四川省资阳市地理位置较远，气候条件差异明显，但4号与17号样品、6号与10号样品具有相同的遗传相似度。在小范围内，6号、7号样品均产自福建省宁德市，但遗传差异显著，遗传距离很大；11号、12号均产自广西省南宁市，遗传相似度为0 79；而1号、2号与12号的遗传相似度为0 86。由此可见，栀子种子的遗传关系与地域没有必然的联系，可能由于不同产地之间最初引进的种源不同。
3 讨论
同工酶是基因编码的产物，它在电场中迁移率的改变反映了酶蛋白的大小、构形和肽链氨基酸的序列变化，即编码DNA上的变化，所以可通过分析同工酶酶谱的变化获得我们所需要的遗传信息 [7]。植物同工酶分析技术为估计植物群体遗传多型性、分析种内及种间差异、探讨植物起源与进化等提供了可靠的试验手段 [8]。利用过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶来研究种间的亲缘关系已经很遍，种子真实性和品种纯度代表种子的遗传品质。在本研究范围内，不同产地种子之间的酶带有共同的分布图谱，也有各自的酶谱特征，说明它们之间存在基因组的差异。
同一居群中一定种类的同工酶谱带相对稳定，所以选择一定种类的同工酶是鉴定药用植物及其原产地的适宜生化指标 [9]。本试验表明，EST、POD同工酶是栀子种子纯度鉴定宜选的酶系统，鉴定不同种源之间的遗传相似度宜选用酯酶同工酶图谱。栀子是我国大宗药材，栽培历史悠久，在引种栽培过程中，受多年的自然环境变化及不同产地之间地理、气候等诸多不同因素的影响，其遗传多样性是否遭到破坏尚不十分清楚。本研究通过对全国范围内具有代表性的20个不同产地栀子种子的酯酶与过氧化物酶同工酶酶谱进行分析，探究不同产地种源之间的遗传多样性，结果表明，不同种源之间的同工酶图谱既有栀子属的共同特征谱带，又具有各自的特征带，说明不同产地的栀子种源既具有一定的遗传稳定性，又存在各自的遗传特征。通过对栀子的过氧化物酶、酯酶同工酶酶谱分析，发现不同产区、不同栽培类型栀子的酶谱均存在一定差异，这也为揭示它们之间药性、药效、有效成分含量存在差异的原因提供一定的研究基础 。
目前栀子通过种子繁育技术大力发展人工种植栽培，而稳定的种源将是保证种子质量的前提与关键 [10]。本研究通过栀子种子酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶来探讨栀子种质遗传关系，本方法具有简便易操作、周期短、成本低等优势。种源间的亲缘关系可根据酶谱特征有效地反映出，便于鉴别种源，有利于筛选优良品种，提高药材产量和质量 [11]。
[HS2 2][HT8 5H]参考文献： [HJ1 8mm]
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[4]邹春静，盛晓峰，韩文卿，等 同工酶分析技术及其在植物研究中的应用[J] 生态学杂志，2003，22（6）：63-69
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[7]季维智，宿 兵 遗传多样性研究的原理与方法[M] 杭州：浙江科学技术出版社，1999：71
[8]伍世平，王君健，于志熙 10种草坪及地被植物的同工酶研究[J] 武汉植物学研究，1994，12（3）：259-262
[9]张袖丽，谢中稳，陶汉之 半夏属植物同工酶的电泳分析[J] 安徽农业大学学报，1997，24（3）：291-295
[10] 方 磊，罗光明，蔡财军 等 草珊瑚种子遗传多样性的酯酶同工酶研究[J] 江西中医学院学报，2011，23（3）：42-44
[11]韩琳娜，李红梅 白花丹参和紫花丹参生化标记分析[J] 时珍国医国药，2009，20（1）：211-212