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摘 要： 将脂肪酶固定化，可以提高酶的专一性及稳定性等，使酶的性质更加稳定，且反应条件温和，副产物少，易于分离。本文综述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共价交联法和包埋法等，研究了不同的固定化方法对酶的性质的影响。
关键词： 脂肪酶 固定化 方法
脂肪酶（又称甘油酯水解酶）是一类广泛用于催化甘油三酯水解的酶类。除了具有水解的功能外，它还可以催化醇解、酯化、酯交换等反应，但在实际使用过程中，游离脂肪酶存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点[1]，因此限制了脂肪酶的进一步应用，然而通过选择合适的载体及固定化方法，将脂肪酶固定化，可以有效解决上述问题。本文介绍了近几年不同学者研究脂肪酶固定化的方法和研究成果，以期为固定化脂肪酶的生产及应用提供参考。
1.固定化脂肪酶的方法
1.1吸附法
吸附法通过氢键、疏水键、电子亲和力等分子间作用力完成酶的固定[2]。吸附法具有工艺简单、酶残余活力高、载体材料丰富的特点。
王冰[3]等以沙蒿多糖-壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定化脂肪酶，对固定化过程中对酶活力有影响的各种因素进行研究，同时对固定化酶的部分理化性质、最适IR、温度、酶的热稳定性和表观米氏常数等与游离酶做了比较。确定固定化脂肪酶的最佳条件为每 0.1g 载体加 2%（w/v）的酶溶液0.9 ml，固定8h，pH 8.4，温度为50℃。
纵伟[4]等以磁性壳聚糖微球为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定固定化的最适宜条件为加酶量600 U/g，温度5℃ ，pH 7.0，固定时间 2h，固定化酶连续使用5 次，其相对酶活仍为使用前的57.8% ，具有较好的操作稳定性。
Liu等[5]采用吸附法将脂肪酶固定在经四乙氧基硅烷修饰的磁性纳米颗粒上，并用此催化橄榄油和甲醇制备生物柴油，发现在室温条件下，当水质量分数为10%、转速为200rpm、醇油比4：1时，反应12h后生物柴油的产率可达70%。
Kuo等[6]以磁性壳聚糖微球为载体，N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺为交联剂制备固定化脂肪酶，利用响应面优化法对固定化条件进行优化，研究发现当固定化时间为2.14h，pH为6.37，酶与载体的质量比为0.73时。固定化脂肪酶脂的热稳定性、pH稳定性均比游离酶有所提高，重复使用20次后，仍然保持83%的初始酶活力。
程娟[7]以脂肪酶为原料，通过单因素试验对影响脂肪酶固定化的因素进行分析，并结合响应面方法确定最佳工艺条件为：硅烷化试剂添加量 0.35%，硅藻土与酶的质量比 3.5：1，温度 29 ℃和时间 4.5h，固定后的脂肪酶活力为206.67 U·g-1。
1.2包埋法
酶的包埋是将脂肪酶捕获到聚合物内部空隙或微囊中的方法。
李刚锐[8]利用溶胶-凝胶法固定脂肪酶，选用TMOS、MTMS、ETMS和PTMS 4 种硅烷试剂对黑曲霉脂肪酶进行了固定化研究。确定固定化的最佳配方为ETMS/TMOS = 5∶1，水与硅烷试剂分子比为8；最适反应 pH为pH 4.0， 固定化脂肪酶最适反应温度为 60℃，较游离脂肪酶提高了 10℃；延长了固定化脂肪酶的使用寿命，提高了保存稳定性，使用12次后仍能够保留 71.7%活性。
虞凤慧等[9]以海藻酸钠和羧甲基纤维素钠为复合载体，研究包埋法固定化毕赤酵母高温碱性脂肪酶。通过单因素试验考察了不同因子对脂肪酶固定化的影响，确定包埋法固定化脂肪酶的最优条件为海藻酸钠含量1.0%、羧甲基纤维素钠含量0.25%、加酶量50 U/（g载体）、CaCl2浓度0.4 mol/L，固定化时间40 min。在此条件下，酶活回收率高达99.50%。
1.3共价键结合法
共价键结合法是先在载体上引进一个活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应形成共价键的方法。
Xu 等[10]研究了将猪胰脂肪酶固定在氨基修饰的 SBA-15 上，结果表明氨基修饰的 SBA-15 固定化酶具有更好的化学稳定性和热稳定性，重复使用五次后酶活性仍达到初始时的 49.2%。
Hu等[11]在 SBA-15上分别修饰三种不同的基团，形成 COOH-IL-SBA、CH3-IL-SBA、NH2-IL-SBA 载体对洋葱假单胞菌脂肪酶的固定化进行研究。结果表明NH2-IL-SBA 固定化酶的水解活性最高，能达到 SBA-15 固定化酶活性的12.39 倍。
Yang等[12]制备了羧基功能化离子液体修饰的 SBA-15，用来固定猪胰脂肪酶。结果显示，羧基功能化离子液体修饰的 SBA-15 对脂肪酶的固定化效率高达 95% 以上，远高于相同条件下的传统 SBA-15 的酶固定化效率。
1.4其他方法
黄磊[13]等研究了泡沫陶瓷的孔径分布和表面性质对脂肪酶固定化的影响。泡沫陶瓷用硅烷偶联剂对其进行表面改性处理后，成功地应用于脂肪酶的固定化。实验结果表明，泡沫陶瓷的纳米孔孔径分布非常适合脂肪酶的固定化，对固定化酶的催化效率有决定性影响。
曲伟光等[14]以氯乙酰化聚苯乙烯微球载体为大分子引发剂，以甲基丙烯酸缩水甘油酯和亲水性丙舰胺为共聚接枝单体，以氯化亚铜及2，2′-联吡啶为催化体系，采用原子转移自由基聚合法合成了具有柔性链的亲水梳状环氧载体PS-acyl-P（AM-co-GMA），让此固定化酶催化对硝基苯酚棕榈酸酯的水解，连续进行7次间歇操作，仍保留初始活性的73.5%；于4℃保存60d，酶活剩余86.8%。经亲水梳状环氧体载体柔性固定化后，该脂肪酶对有机溶剂的耐受性也比较好。
2.展望
以上综述了吸附法、包埋法、共价键结合法固定化脂肪酶研究的新进展。吸附法操作简单，载体种类丰富，但脂肪酶与载体的结合通过物理吸附，连接不紧密，容易脱落；包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构， 酶活回收率较高，可应用于许多酶、微生物和细胞器的固定化；共价键结合法与吸附法相比反应条件苛刻，操作复杂，会改变或破坏部分酶的活性中心，使活力回收率较低， 但是酶与载体结合较牢固，酶不易脱落，稳定性好。如何克服单独使用这些方法的缺点成为应用固定化酶的主要障碍。希望未来，随着固定化技术的研究，载体材料选择及改性方法的成熟，吸附法能够更好地与包埋法、化学法等结合发展固定化脂肪酶技术，让该项技术能够更好更方便地应用于各个领域。 参考文献：
[1]陈秀琳.脂肪酶固定化的研究概况[J].海峡药学，2007，19（12）：114-116.
[2]Yau J L，Noble J，Graham M，et al.Central administrationof a Cytochrome P450 -7B product 7α -hydroxypregnenolone improves spatial memory retention incognitively impaired aged rats [J].Neuroscience，2006，26（43）：11034-11040.
[3]王冰，王云普，曾家豫，等.沙蒿胶磁性微球固定化脂肪酶及部分理化性质的研究[J].食品工业科技，2008，29（1）：143-145.
[4]纵伟，刘艳芳，赵光远.磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究[J].食品与机械，2008，24（1）：13-15.
[5]Liu C，Huang C，Wang Y，et al.[J].Applied EnergyClean Energy for FutureGenerations，2012，100：41-46.
[6]Kuo C，Liu Y，Chang C J，et al.[J].Carbohydrate Polymers，2012，87（4）：2538-2545.
[7]程娟，鹿保鑫，等.脂肪酶的固定化及其性能研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（1）：45-50.
[8]李刚锐，李林俐，等.溶胶凝胶法固定化黑曲霉脂肪酶的性质研究[J].中国生物工程杂志，2014，34（4）：78-84.
[9]虞凤慧，马韵升，等.海藻酸钠与羧甲基纤维素钠固定化高温碱性脂肪酶[J].China Brewing，2015，5（134）：78-81.
[10]Xu Y Q，Zhou G W，Wu C C，et al.Improving adsorption and activation of the lipase immobilized in amino-functionalized ordered mesoporousSBA-15[J].Solid State Sci，2011，13：867.
[11]Hu Y，Tang S S，Jiang L，et al.Immobilization of Burkholderia cepacia lipase on functionalized ionic liquids modified mesoporous silica SBA-15[J].Process Biochemistry，2012，9.
[12]Yang J，Hu Y，Jiang L，et al.Enhancing the catalytic properties of porcine pancreatic lipase by immobilization on SBA-15 modified byfunctionalized ionic liquid[J].Biochemical Engineering Journal，2013，70：46-54.
[13]黄磊，程振民.纳米-微米复合孔泡沫陶瓷固定化脂肪酶[J].催化学报，2008，29（1）：57-62.
[14]曲伟光，魏荣卿，何冰芳，等.亲水梳状环氧聚合物载体柔性固定化脂肪酶[J].催化学报，2011，32（12）：1869-1874.
关键词： 脂肪酶 固定化 方法
脂肪酶（又称甘油酯水解酶）是一类广泛用于催化甘油三酯水解的酶类。除了具有水解的功能外，它还可以催化醇解、酯化、酯交换等反应，但在实际使用过程中，游离脂肪酶存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点[1]，因此限制了脂肪酶的进一步应用，然而通过选择合适的载体及固定化方法，将脂肪酶固定化，可以有效解决上述问题。本文介绍了近几年不同学者研究脂肪酶固定化的方法和研究成果，以期为固定化脂肪酶的生产及应用提供参考。
1.固定化脂肪酶的方法
1.1吸附法
吸附法通过氢键、疏水键、电子亲和力等分子间作用力完成酶的固定[2]。吸附法具有工艺简单、酶残余活力高、载体材料丰富的特点。
王冰[3]等以沙蒿多糖-壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定化脂肪酶，对固定化过程中对酶活力有影响的各种因素进行研究，同时对固定化酶的部分理化性质、最适IR、温度、酶的热稳定性和表观米氏常数等与游离酶做了比较。确定固定化脂肪酶的最佳条件为每 0.1g 载体加 2%（w/v）的酶溶液0.9 ml，固定8h，pH 8.4，温度为50℃。
纵伟[4]等以磁性壳聚糖微球为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定固定化的最适宜条件为加酶量600 U/g，温度5℃ ，pH 7.0，固定时间 2h，固定化酶连续使用5 次，其相对酶活仍为使用前的57.8% ，具有较好的操作稳定性。
Liu等[5]采用吸附法将脂肪酶固定在经四乙氧基硅烷修饰的磁性纳米颗粒上，并用此催化橄榄油和甲醇制备生物柴油，发现在室温条件下，当水质量分数为10%、转速为200rpm、醇油比4：1时，反应12h后生物柴油的产率可达70%。
Kuo等[6]以磁性壳聚糖微球为载体，N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺为交联剂制备固定化脂肪酶，利用响应面优化法对固定化条件进行优化，研究发现当固定化时间为2.14h，pH为6.37，酶与载体的质量比为0.73时。固定化脂肪酶脂的热稳定性、pH稳定性均比游离酶有所提高，重复使用20次后，仍然保持83%的初始酶活力。
程娟[7]以脂肪酶为原料，通过单因素试验对影响脂肪酶固定化的因素进行分析，并结合响应面方法确定最佳工艺条件为：硅烷化试剂添加量 0.35%，硅藻土与酶的质量比 3.5：1，温度 29 ℃和时间 4.5h，固定后的脂肪酶活力为206.67 U·g-1。
1.2包埋法
酶的包埋是将脂肪酶捕获到聚合物内部空隙或微囊中的方法。
李刚锐[8]利用溶胶-凝胶法固定脂肪酶，选用TMOS、MTMS、ETMS和PTMS 4 种硅烷试剂对黑曲霉脂肪酶进行了固定化研究。确定固定化的最佳配方为ETMS/TMOS = 5∶1，水与硅烷试剂分子比为8；最适反应 pH为pH 4.0， 固定化脂肪酶最适反应温度为 60℃，较游离脂肪酶提高了 10℃；延长了固定化脂肪酶的使用寿命，提高了保存稳定性，使用12次后仍能够保留 71.7%活性。
虞凤慧等[9]以海藻酸钠和羧甲基纤维素钠为复合载体，研究包埋法固定化毕赤酵母高温碱性脂肪酶。通过单因素试验考察了不同因子对脂肪酶固定化的影响，确定包埋法固定化脂肪酶的最优条件为海藻酸钠含量1.0%、羧甲基纤维素钠含量0.25%、加酶量50 U/（g载体）、CaCl2浓度0.4 mol/L，固定化时间40 min。在此条件下，酶活回收率高达99.50%。
1.3共价键结合法
共价键结合法是先在载体上引进一个活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应形成共价键的方法。
Xu 等[10]研究了将猪胰脂肪酶固定在氨基修饰的 SBA-15 上，结果表明氨基修饰的 SBA-15 固定化酶具有更好的化学稳定性和热稳定性，重复使用五次后酶活性仍达到初始时的 49.2%。
Hu等[11]在 SBA-15上分别修饰三种不同的基团，形成 COOH-IL-SBA、CH3-IL-SBA、NH2-IL-SBA 载体对洋葱假单胞菌脂肪酶的固定化进行研究。结果表明NH2-IL-SBA 固定化酶的水解活性最高，能达到 SBA-15 固定化酶活性的12.39 倍。
Yang等[12]制备了羧基功能化离子液体修饰的 SBA-15，用来固定猪胰脂肪酶。结果显示，羧基功能化离子液体修饰的 SBA-15 对脂肪酶的固定化效率高达 95% 以上，远高于相同条件下的传统 SBA-15 的酶固定化效率。
1.4其他方法
黄磊[13]等研究了泡沫陶瓷的孔径分布和表面性质对脂肪酶固定化的影响。泡沫陶瓷用硅烷偶联剂对其进行表面改性处理后，成功地应用于脂肪酶的固定化。实验结果表明，泡沫陶瓷的纳米孔孔径分布非常适合脂肪酶的固定化，对固定化酶的催化效率有决定性影响。
曲伟光等[14]以氯乙酰化聚苯乙烯微球载体为大分子引发剂，以甲基丙烯酸缩水甘油酯和亲水性丙舰胺为共聚接枝单体，以氯化亚铜及2，2′-联吡啶为催化体系，采用原子转移自由基聚合法合成了具有柔性链的亲水梳状环氧载体PS-acyl-P（AM-co-GMA），让此固定化酶催化对硝基苯酚棕榈酸酯的水解，连续进行7次间歇操作，仍保留初始活性的73.5%；于4℃保存60d，酶活剩余86.8%。经亲水梳状环氧体载体柔性固定化后，该脂肪酶对有机溶剂的耐受性也比较好。
2.展望
以上综述了吸附法、包埋法、共价键结合法固定化脂肪酶研究的新进展。吸附法操作简单，载体种类丰富，但脂肪酶与载体的结合通过物理吸附，连接不紧密，容易脱落；包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构， 酶活回收率较高，可应用于许多酶、微生物和细胞器的固定化；共价键结合法与吸附法相比反应条件苛刻，操作复杂，会改变或破坏部分酶的活性中心，使活力回收率较低， 但是酶与载体结合较牢固，酶不易脱落，稳定性好。如何克服单独使用这些方法的缺点成为应用固定化酶的主要障碍。希望未来，随着固定化技术的研究，载体材料选择及改性方法的成熟，吸附法能够更好地与包埋法、化学法等结合发展固定化脂肪酶技术，让该项技术能够更好更方便地应用于各个领域。 参考文献：
[1]陈秀琳.脂肪酶固定化的研究概况[J].海峡药学，2007，19（12）：114-116.
[2]Yau J L，Noble J，Graham M，et al.Central administrationof a Cytochrome P450 -7B product 7α -hydroxypregnenolone improves spatial memory retention incognitively impaired aged rats [J].Neuroscience，2006，26（43）：11034-11040.
[3]王冰，王云普，曾家豫，等.沙蒿胶磁性微球固定化脂肪酶及部分理化性质的研究[J].食品工业科技，2008，29（1）：143-145.
[4]纵伟，刘艳芳，赵光远.磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶的研究[J].食品与机械，2008，24（1）：13-15.
[5]Liu C，Huang C，Wang Y，et al.[J].Applied EnergyClean Energy for FutureGenerations，2012，100：41-46.
[6]Kuo C，Liu Y，Chang C J，et al.[J].Carbohydrate Polymers，2012，87（4）：2538-2545.
[7]程娟，鹿保鑫，等.脂肪酶的固定化及其性能研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（1）：45-50.
[8]李刚锐，李林俐，等.溶胶凝胶法固定化黑曲霉脂肪酶的性质研究[J].中国生物工程杂志，2014，34（4）：78-84.
[9]虞凤慧，马韵升，等.海藻酸钠与羧甲基纤维素钠固定化高温碱性脂肪酶[J].China Brewing，2015，5（134）：78-81.
[10]Xu Y Q，Zhou G W，Wu C C，et al.Improving adsorption and activation of the lipase immobilized in amino-functionalized ordered mesoporousSBA-15[J].Solid State Sci，2011，13：867.
[11]Hu Y，Tang S S，Jiang L，et al.Immobilization of Burkholderia cepacia lipase on functionalized ionic liquids modified mesoporous silica SBA-15[J].Process Biochemistry，2012，9.
[12]Yang J，Hu Y，Jiang L，et al.Enhancing the catalytic properties of porcine pancreatic lipase by immobilization on SBA-15 modified byfunctionalized ionic liquid[J].Biochemical Engineering Journal，2013，70：46-54.
[13]黄磊，程振民.纳米-微米复合孔泡沫陶瓷固定化脂肪酶[J].催化学报，2008，29（1）：57-62.
[14]曲伟光，魏荣卿，何冰芳，等.亲水梳状环氧聚合物载体柔性固定化脂肪酶[J].催化学报，2011，32（12）：1869-1874.