【摘 要】
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目的探讨人丝裂原激活蛋白激酶3（MAPK3）基因原核表达载体的构建及鉴定。方法取对数生长期正常人肝细胞系HL-7702细胞,采用TRIzol法抽提细胞总RNA,以此为模板用反转录聚合酶链式反应（RTPCR）反转录扩增MAPK3基因的蛋白编码区,脱氧核糖核苷酸（DNA）测序鉴定后插入原核表达载体pGEX-4t-1中构建重组原核表达质粒(命名为pGEX-MAPK3GST);将pGEX-MAPK3GST
【基金项目】
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国家自然科学基金（81560390）； 贵州省科学技术基金[黔科合基础（2017）1147]；
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目的探讨人丝裂原激活蛋白激酶3（MAPK3）基因原核表达载体的构建及鉴定。方法取对数生长期正常人肝细胞系HL-7702细胞,采用TRIzol法抽提细胞总RNA,以此为模板用反转录聚合酶链式反应（RTPCR）反转录扩增MAPK3基因的蛋白编码区,脱氧核糖核苷酸（DNA）测序鉴定后插入原核表达载体pGEX-4t-1中构建重组原核表达质粒(命名为pGEX-MAPK3GST);将pGEX-MAPK3GST导入细菌Rosetta（DE3）中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达MAPK3融合蛋白（GST-MAPK3）,采用Sepharose 4B亲和层析法纯化MAPK3融合蛋白（GST-MAPK3）,采用考马斯亮蓝染色和蛋白免疫印迹分析GST-MAPK3的蛋白纯度和验证目的蛋白。结果 RT-PCR法成功克隆了人MAPK3基因的蛋白编码区,DNA测序结果显示该片段无任何突变;用克隆获得的基因片段成功构建了pGEX-MAPK3GST,通过原核表达的方式获得了GST-MAPK3,并通过亲和层析纯化了GSTMAPK3。结论成功克隆人MAPK3基因并获得MAPK3蛋白,可用于体外研究MAPK3对细胞角蛋白18（CK18）的磷酸化作用。
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