【摘 要】
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目的 利用昆虫杆状病毒表达系统得到epsin2蛋白质并进行纯化后,探索其能否在体外发生液-液相分离.方法 构建pmCherryC1-epsin2载体,在HeLa细胞内过表达后观察其胞内状态.构建
【机 构】
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国家生物医学分析中心,北京 100850
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目的 利用昆虫杆状病毒表达系统得到epsin2蛋白质并进行纯化后,探索其能否在体外发生液-液相分离.方法 构建pmCherryC1-epsin2载体,在HeLa细胞内过表达后观察其胞内状态.构建pFastBac HT-B-mCherry-epsin2蛋白质纯化载体,转染昆虫细胞Sf9,获得His-mCherry-epsin2融合蛋白质.进一步探索epsin2蛋白质能否在体外发生液-液相分离以及不同蛋白质浓度、盐浓度等对其的影响.结果 PONDR数据库分析发现,epsin2 C端有明显的低复杂无序区域.HeLa细胞内过表达pmCherryC1-epsin2后发现epsin2蛋白质在细胞质呈点状聚集.pFastBac HT-B-mCherry-epsin2蛋白质纯化载体构建成功后,通过转染Sf9细胞获得His-mCherry-epsin2融合蛋白质.经过镍柱和快速蛋白质液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)纯化获得高纯度的His-mCherry-epsin2蛋白质,通过宽场荧光高分辨率活细胞成像系统观察发现mCherry-epsin2蛋白质发生了浓度依赖的液-液相分离,且可受高盐及1,6-HD抑制.结论 成功纯化出His-mCherry-epsin2融合蛋白质并发现其在体外可以发生液-液相分离,为后续探索epsin2如何通过相分离参与网格蛋白介导内吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)调节生理功能奠定了基础.
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