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摘要 在蓝莓组培过程中很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，这些都直接限制了蓝莓规模化生产。本文总结了蓝莓组织培养过程中污染、褐变、玻璃化现象的主要防止措施，以期为蓝莓组织培养提供参考。
关键词 蓝莓；组织培养；污染；褐变；玻璃化；防止措施
中图分类号 S633.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）10-0105-02
蓝莓为多年生小灌木树种，春季早花，夏季果熟，入秋叶呈红色，观赏效果极佳，可作为观光果园栽培树种，也可制作盆景；其果实中含有花青素、黄酮等多种多酚类生理活性成分，具有明目、防止脑神经衰老、抗癌、抗氧化等多种生理活性功能，越来越受到消费者的青睐，经济价值较高，市场潜力巨大，开发前景广阔。蓝莓组培育苗技术的研究，采用蓝莓组培快繁技术，短期内获得大量的无病毒苗木。探讨蓝莓苗木的工厂化技术育苗体系，有助于我国蓝莓产业化发展，满足社会需求[1-2]。但在蓝莓组培过程中，很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，限制了蓝莓的组培快繁和大规模生产，是目前急需解决的关键问题。笔者总结了蓝莓组织培养繁育中常出现的污染、褐变、玻璃化的防止措施，对蓝莓苗木的快速繁殖和推广具有重要意义。
1 污染
1.1 操作人员注意卫生
首先要注意工作人员卫生，工作人员进入无菌室不能吃东西、吸烟等，应常剪指甲。工作服要每周清洗消毒1次，夏季要每3 d清洗消毒1次，工作服灭菌后在缓冲室更换；一次性用品要及时更换，口罩、帽子要经常清洗。进入无菌室前要用肥皂洗手，进入培养室后再用75%酒精对双手进行消毒[3]。
1.2 改善接种室环境条件
接种室应保持密闭、洁净；培养室应控制空气相对湿度在70%左右，湿度太高时可用抽湿机除湿。每次接种前均应清洁接种室的地面，并喷75%酒精沉降灰尘，然后打开紫外灯灭菌20～30 min，紫外灯灭菌结束后，用75%酒精擦洗工作台面。每次接种结束时，应清洁接种室的地面，并定期清洗无菌操作台的过滤膜和用甲醛熏蒸接种室[4]。
1.3 对培养基及接种工具彻底灭菌
培养瓶在使用之前要彻底清洗，所用的培养基以及接种过程中使用的器具也要严格灭菌。一是培养基灭菌。培养基需要在121 ℃条件下灭菌20～30 min，一般灭菌后的培养基不能放置太久，1～2 d内用完最好，最长不能超过1周，以减少培养瓶污染。二是接种器具灭菌。将接菌器具用报纸、牛皮纸等包扎严密，进行高温高压灭菌。由于采用的是高压湿热灭菌，外层包裹的报纸易破，故要轻拿轻放。一旦报纸、牛皮纸等破裂，灭菌的工具与空气接触，就必须重新灭菌[5]。
1.4 严格选择及消毒外植体
一般情况下选择在春季晴天中午采集外植体，尽量选择温室内的植株或新生嫩芽。外植体消毒前先剪掉多余的枝、叶等组织，然后用自来水冲洗表面的灰尘和杂物，大约冲洗30 min。外植体消毒在超净工作台上进行，将修剪、冲洗后的外植体放入烧杯中，用洗涤剂水浸泡3 min后，用水冲洗干净，然后用无菌水冲洗1遍，再用次氯酸钠或0.1%升汞溶液浸泡10～30 min（视植株品种幼嫩程度而定）消毒，消毒后用无菌水冲洗4～5遍。注意消毒剂对植物有毒害作用，应正确选择消毒剂的浓度、种类和处理时间，尽量减轻对外植体的伤害。
1.5 合理添加抗生素
在培养基中添加抗生素的主要目的是防止外植体内生菌造成的污染，减少培养材料的损失。但是，在使用抗生素时，必须明确使用的抗生素是否会对培养的植物组织有不良影响以及抗生素抑制的病菌种类、使用浓度和处理时间。因为不存在对所有微生物都有效的抗生素，所以在培养基中添加抗生素只能作为防止污染的辅助措施[4]。
2 褐变
2.1 选择适当的外植体
不同时期和年龄的外植体在培养中褐变的程度不同。因此，选择适当的外植体是克服褐变的重要手段。旺盛生长状态的外植体，分生能力较强，其褐变程度低，是组培的首选材料。Danhua和Carole研究了外植体起源与组织褐变的关系，认为腋生枝的顶芽较其他部位枝的顶芽褐变率低，生长在避荫处的外植体较全光下的褐变率低[5]。
2.2 对外植体进行预处理
预处理可减轻酚类物质对外植体的毒害作用。外植体经流水处理后，置于冰箱（5 ℃左右）中12～20 h后，先接种到只添加蔗糖的琼脂培养基中培养5～7 d，使外植体组织中部分酚类物质渗入培养基，然后取出外植体用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再接种到合适的培养基中培养，可有效抑制褐变。
2.3 选择合适的培养基和培养条件
培养基中适宜的无机盐成分、蔗糖浓度、激素组合、激素水平以及抗褐变剂可减轻褐变现象。通过改良WPM培养基有利于抑制外植体的褐变，通过增加琼脂用量调节培养基硬度，可抑制褐变发生，琼脂添加量以8 g/L效果最好。在培养基中加入活性炭和VC液都能一定程度地抑制褐变，促进外植体生长，以活性炭的抑制作用较明显；当综合运用VC液与活性炭时，以活性炭浓度为100～200 mg/L时，效果最好[6]。在培养过程中要保持适宜的培养条件。培养初期保持在15～20 ℃、黑暗或弱光下培养，可减轻培养材料的褐变[7]。在接种1～2 d后，将外植体转移至新鲜培养基或同一培养基的不同部位，连续转移5～6次可防止酚类物质在伤口周围积累过多，有效防止褐变。
3 玻璃化苗预防措施
3.1 在培养基中适当增加无机营养成分，减少氮素含量
适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯的比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例[8]。
3.2 適当提高培养基中琼脂和蔗糖的浓度
适当提高培养基中琼脂的浓度，可以有效克服蓝莓组培苗玻璃化。但若琼脂浓度过大，会导致培养基过硬，影响养分吸收，造成组培苗生长不良。因此，培养基中琼脂的浓度以8 g/L较适宜。蔗糖的用量对蓝莓组培苗玻璃化现象也有一定影响，综合考虑组培苗的长势、节约成本和减少污染等方面，蔗糖用量以25 g/L为宜[9]。
3.3 适当降低细胞分裂素的浓度
在蓝莓组织培养中，组培苗玻璃化程度随着培养基中ZT含量的提高而增加，降低ZT含量，玻璃化苗率显著降低。但培养基中ZT浓度过低会不利于组培苗的生长分化，ZT 浓度以2 mg/L较适宜[9]。
3.4 增加自然光照，控制光照时间
将玻璃化苗放在自然光下几天后，茎叶变红，玻璃化逐渐消失。但是光照时间不宜太长，以8～12 h为宜；光照强度为1 000～1 800 lx时就能满足蓝莓的生长发育要求，并能有效防止玻璃化[8]。
4 参考文献
[1] 于强波，苏丹，于立杰，等.蓝莓组培育苗技术[J].北方园艺，2010（9）：163-163.
[2] 范兆和.界蓝莓生产历史与发展趋势[J].落叶果树，2003（1）：50-52.
[3] 任目瑾，周建峰.植物组织培养的常见污染及其防控技术[J].陕西林业科技，2016（6）：103-105.
[4] 陈玉生，梁秋月，洪向平.植物组织培养污染防治措施[J].广东农业科学，2008（1）：28-29.
[5] 贾鹏博，姜秀煜，高方.蓝莓组织培养污染分析及防治[J].内蒙古林业调查设计，2011（6）：118-119.
[6] 郑理乔，黄成林，刘华，等.兔眼蓝莓组织培养过程中褐化与生根问题的探讨[J].安徽农业大学学报，2012，39（5）：777-782.
[7] 陈惠娟.植物组织培养中褐变的产生机理及克服措施[J].植物保护，2005，31（2）：79-82.
[8] 陈世昌.植物组织培养[M].北京：高等教育出版社，2015：89-93.
[9] 毕云，苏艳，张艺萍，等.蓝莓组织培养过程中玻璃化现象的防止技术研究[J].西南农业学报，2014，27 （6）：2539-2542.
关键词 蓝莓；组织培养；污染；褐变；玻璃化；防止措施
中图分类号 S633.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）10-0105-02
蓝莓为多年生小灌木树种，春季早花，夏季果熟，入秋叶呈红色，观赏效果极佳，可作为观光果园栽培树种，也可制作盆景；其果实中含有花青素、黄酮等多种多酚类生理活性成分，具有明目、防止脑神经衰老、抗癌、抗氧化等多种生理活性功能，越来越受到消费者的青睐，经济价值较高，市场潜力巨大，开发前景广阔。蓝莓组培育苗技术的研究，采用蓝莓组培快繁技术，短期内获得大量的无病毒苗木。探讨蓝莓苗木的工厂化技术育苗体系，有助于我国蓝莓产业化发展，满足社会需求[1-2]。但在蓝莓组培过程中，很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，限制了蓝莓的组培快繁和大规模生产，是目前急需解决的关键问题。笔者总结了蓝莓组织培养繁育中常出现的污染、褐变、玻璃化的防止措施，对蓝莓苗木的快速繁殖和推广具有重要意义。
1 污染
1.1 操作人员注意卫生
首先要注意工作人员卫生，工作人员进入无菌室不能吃东西、吸烟等，应常剪指甲。工作服要每周清洗消毒1次，夏季要每3 d清洗消毒1次，工作服灭菌后在缓冲室更换；一次性用品要及时更换，口罩、帽子要经常清洗。进入无菌室前要用肥皂洗手，进入培养室后再用75%酒精对双手进行消毒[3]。
1.2 改善接种室环境条件
接种室应保持密闭、洁净；培养室应控制空气相对湿度在70%左右，湿度太高时可用抽湿机除湿。每次接种前均应清洁接种室的地面，并喷75%酒精沉降灰尘，然后打开紫外灯灭菌20～30 min，紫外灯灭菌结束后，用75%酒精擦洗工作台面。每次接种结束时，应清洁接种室的地面，并定期清洗无菌操作台的过滤膜和用甲醛熏蒸接种室[4]。
1.3 对培养基及接种工具彻底灭菌
培养瓶在使用之前要彻底清洗，所用的培养基以及接种过程中使用的器具也要严格灭菌。一是培养基灭菌。培养基需要在121 ℃条件下灭菌20～30 min，一般灭菌后的培养基不能放置太久，1～2 d内用完最好，最长不能超过1周，以减少培养瓶污染。二是接种器具灭菌。将接菌器具用报纸、牛皮纸等包扎严密，进行高温高压灭菌。由于采用的是高压湿热灭菌，外层包裹的报纸易破，故要轻拿轻放。一旦报纸、牛皮纸等破裂，灭菌的工具与空气接触，就必须重新灭菌[5]。
1.4 严格选择及消毒外植体
一般情况下选择在春季晴天中午采集外植体，尽量选择温室内的植株或新生嫩芽。外植体消毒前先剪掉多余的枝、叶等组织，然后用自来水冲洗表面的灰尘和杂物，大约冲洗30 min。外植体消毒在超净工作台上进行，将修剪、冲洗后的外植体放入烧杯中，用洗涤剂水浸泡3 min后，用水冲洗干净，然后用无菌水冲洗1遍，再用次氯酸钠或0.1%升汞溶液浸泡10～30 min（视植株品种幼嫩程度而定）消毒，消毒后用无菌水冲洗4～5遍。注意消毒剂对植物有毒害作用，应正确选择消毒剂的浓度、种类和处理时间，尽量减轻对外植体的伤害。
1.5 合理添加抗生素
在培养基中添加抗生素的主要目的是防止外植体内生菌造成的污染，减少培养材料的损失。但是，在使用抗生素时，必须明确使用的抗生素是否会对培养的植物组织有不良影响以及抗生素抑制的病菌种类、使用浓度和处理时间。因为不存在对所有微生物都有效的抗生素，所以在培养基中添加抗生素只能作为防止污染的辅助措施[4]。
2 褐变
2.1 选择适当的外植体
不同时期和年龄的外植体在培养中褐变的程度不同。因此，选择适当的外植体是克服褐变的重要手段。旺盛生长状态的外植体，分生能力较强，其褐变程度低，是组培的首选材料。Danhua和Carole研究了外植体起源与组织褐变的关系，认为腋生枝的顶芽较其他部位枝的顶芽褐变率低，生长在避荫处的外植体较全光下的褐变率低[5]。
2.2 对外植体进行预处理
预处理可减轻酚类物质对外植体的毒害作用。外植体经流水处理后，置于冰箱（5 ℃左右）中12～20 h后，先接种到只添加蔗糖的琼脂培养基中培养5～7 d，使外植体组织中部分酚类物质渗入培养基，然后取出外植体用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再接种到合适的培养基中培养，可有效抑制褐变。
2.3 选择合适的培养基和培养条件
培养基中适宜的无机盐成分、蔗糖浓度、激素组合、激素水平以及抗褐变剂可减轻褐变现象。通过改良WPM培养基有利于抑制外植体的褐变，通过增加琼脂用量调节培养基硬度，可抑制褐变发生，琼脂添加量以8 g/L效果最好。在培养基中加入活性炭和VC液都能一定程度地抑制褐变，促进外植体生长，以活性炭的抑制作用较明显；当综合运用VC液与活性炭时，以活性炭浓度为100～200 mg/L时，效果最好[6]。在培养过程中要保持适宜的培养条件。培养初期保持在15～20 ℃、黑暗或弱光下培养，可减轻培养材料的褐变[7]。在接种1～2 d后，将外植体转移至新鲜培养基或同一培养基的不同部位，连续转移5～6次可防止酚类物质在伤口周围积累过多，有效防止褐变。
3 玻璃化苗预防措施
3.1 在培养基中适当增加无机营养成分，减少氮素含量
适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯的比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例[8]。
3.2 適当提高培养基中琼脂和蔗糖的浓度
适当提高培养基中琼脂的浓度，可以有效克服蓝莓组培苗玻璃化。但若琼脂浓度过大，会导致培养基过硬，影响养分吸收，造成组培苗生长不良。因此，培养基中琼脂的浓度以8 g/L较适宜。蔗糖的用量对蓝莓组培苗玻璃化现象也有一定影响，综合考虑组培苗的长势、节约成本和减少污染等方面，蔗糖用量以25 g/L为宜[9]。
3.3 适当降低细胞分裂素的浓度
在蓝莓组织培养中，组培苗玻璃化程度随着培养基中ZT含量的提高而增加，降低ZT含量，玻璃化苗率显著降低。但培养基中ZT浓度过低会不利于组培苗的生长分化，ZT 浓度以2 mg/L较适宜[9]。
3.4 增加自然光照，控制光照时间
将玻璃化苗放在自然光下几天后，茎叶变红，玻璃化逐渐消失。但是光照时间不宜太长，以8～12 h为宜；光照强度为1 000～1 800 lx时就能满足蓝莓的生长发育要求，并能有效防止玻璃化[8]。
4 参考文献
[1] 于强波，苏丹，于立杰，等.蓝莓组培育苗技术[J].北方园艺，2010（9）：163-163.
[2] 范兆和.界蓝莓生产历史与发展趋势[J].落叶果树，2003（1）：50-52.
[3] 任目瑾，周建峰.植物组织培养的常见污染及其防控技术[J].陕西林业科技，2016（6）：103-105.
[4] 陈玉生，梁秋月，洪向平.植物组织培养污染防治措施[J].广东农业科学，2008（1）：28-29.
[5] 贾鹏博，姜秀煜，高方.蓝莓组织培养污染分析及防治[J].内蒙古林业调查设计，2011（6）：118-119.
[6] 郑理乔，黄成林，刘华，等.兔眼蓝莓组织培养过程中褐化与生根问题的探讨[J].安徽农业大学学报，2012，39（5）：777-782.
[7] 陈惠娟.植物组织培养中褐变的产生机理及克服措施[J].植物保护，2005，31（2）：79-82.
[8] 陈世昌.植物组织培养[M].北京：高等教育出版社，2015：89-93.
[9] 毕云，苏艳，张艺萍，等.蓝莓组织培养过程中玻璃化现象的防止技术研究[J].西南农业学报，2014，27 （6）：2539-2542.