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摘要：本试验对板栗褐缘叶枯病病原菌——板栗拟茎点霉菌生物学特性进行了研究。结果表明：病原菌菌丝在PSA培养基上生长最快；病原菌最易利用的碳源是葡萄糖，最易利用的氮源是氯化铵和甘氨酸；菌丝生长的最适温度为25℃，最适pH值为5～6。病原菌分生孢子在清水及多种营养液中均可以直接萌发，孢子萌发最适温度为20～30℃，最适相对湿度为85％，最适pH值为50
关键词：板栗褐缘叶枯病；病原菌；生物学特性
中图分类号：Q949.32 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2010)04－0052－04
板栗是山东重要的干果产品之一。自2004年以来，在山东泰安、济南、潍坊、临沂等几个板栗产区相继发生了一种新的叶部病害——板栗褐缘叶枯病(Phomopsis mollissima Y.Z.Hua＆S.X.Jiang)，该病的主要症状为板栗叶片上初期产生褐色斑点，随后病斑迅速扩大，呈不规则大面积干枯。病叶9月中、下旬开始大量落叶，10月中、下旬二次发芽抽梢，新发枝梢冬季枯死，又极易诱发板栗疫病，引起林木整株死亡。近几年来，该病发生面积逐年扩大，危害程度逐年加重，给各地板栗树生长和产量均造成了不同程度的危害和损失。如泰安市徂徕山林场2005年十年生板栗树死亡800余株，2006年死亡9000余株，减产近15×10kg。根据目前国内外发表的有关板栗叶斑病类的文献，均没有对该病害的报道。2007年开始，作者对其病原及生物学特性、发病规律及防治方法进行了系统的研究。本试验对该病原菌的生物学特性进行了研究，以期为该病害的防治提供理论基础与技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：板栗褐缘叶枯病叶采自泰安市徂徕山林场光化寺林区。采带有病斑的新鲜板栗叶片，在病斑的病健交界处进行组织分离。按柯赫氏法则进行致病性测定，经过对病原菌形态学和分子生物学鉴定后，单孢分离，保存于4℃冰箱中备用。
供试孢子：将病原菌菌饼接种到PSA板栗汁培养基上，在25℃恒温条件下培养，12d左右在呈灰褐色菌落上开始产生载孢体，载孢体25℃条件下培养40 d左右产生成熟的甲、乙型分生孢子，在15～25℃变温、散色光的条件下易破裂，释放出成团的桔黄色黏稠状溢出物，即甲型孢子，作为本次试验所用孢子。
1.2 研究方法
1.2.1 不同培养基对菌丝生长的影响
选用PSA培养基(马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾5 g、清水1 000 m1)、PSA板栗汁培养基(马铃薯200 g、板栗汁5 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾5 g、清水1 000 ml)、燕麦培养基(燕麦30 g、琼脂25 g、清水1000 ml)、燕麦马铃薯培养基(马铃薯200 g、燕麦30 g、硫酸镁20 g、琼脂20 g、蔗糖20 g、清水1 000 ml)、玉米培养基(玉米粉50 g、琼脂10 g、清水1 000 m1)5种培养基，以清水琼脂培养基为对照。将病原菌沿菌落边缘取直径5 mm的菌饼移植到培养基平板中央，25℃恒温培养，于接种后的第72、96、120 h用十字交叉法测量菌落直径，并计算平均值。每个处理重复4次。
1.2.2 不同温度对菌丝生长和孢子萌发的影响
将病原菌沿菌落边缘取直径5 mm的菌饼移植到PSA板栗汁培养基平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃等7个不同温度梯度下培养，于接种后120 h测量菌落直径，每个处理重复4次。以pH 6的0.2％板栗汁配制孢子悬浮液(15×40倍视野镜下10～20个孢子)，滴于凹玻片上，分别放置于10、15、20、25、30、35、40℃下进行培养，18 h后观察其萌发率，每处理重复4次。
1.2.3 不同pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响将板栗汁PSA培养基灭菌后用灭菌的NaOH和HCl分别调pH值至2、3、4、5、6、7、8、9，然后制成平板。接5 into的菌饼后，在25℃温度下恒温箱中培养，于接种后120 h测量菌落直径，每个处理重复4次。配置0，2％板栗汁孢子液(10×40倍视野镜下10~20个孢子)，以1 mol/L NaOH和HCI调节溶液，形成pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的梯度。用载玻片孢子萌发法，将孢子液滴于凹玻片上，放置在25％培养箱中，18 h后观察其萌发率。每处理重复4次。
1.2.4 不同碳源对菌丝生长的影响基本培养基为PDA板栗汁培养基(马铃薯200 g、板栗汁5 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾5 g、水1000 ml)，以2％葡萄糖为碳源，分别以相同含碳量的蔗糖、木糖、果糖、淀粉、甘露醇、麦芽糖、甘油替换葡萄糖，配制成含有不同碳源的培养基。以清水琼脂培养基为对照。从病原菌菌落边缘取直径5 mm的菌饼，分别接种到上述不同碳源的培养基上，置于25℃下恒温箱中培养，于接种后48、96 h测量菌落直径，每个处理重复4次。
1.2.5 不同氮源对菌丝生长的影响基本培养基为PSA板栗汁培养基(马铃薯200 g、板栗叶5 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、硝酸钠2 g、磷酸二氢钾5 g、水1000 m1)，以硝酸钠为氮源，分别以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、氯化铵、硝酸钾、酵母、天冬酰胺替代硝酸钠，配制成含有不同氮源的培养基。其它方法同1.2.4。
1.2.6 不同营养成分对孢子萌发的影响
采用载玻片孢子萌发法，用0.5％板栗汁、0.2％蔗糖、0.2％葡萄糖、0.2％马铃薯汁及无菌水分别配制一定浓度(15×40倍视野镜下10～20个孢子)的孢子悬浮液，各取一滴滴在凹玻片上，放置在25℃培养箱中培养18 h后观察其萌发率，每处理重复4次。
1.2.7 不同湿度对孢子萌发的影响在干燥器内用不同浓度的硫酸调制成90％、85％、75％、65％、50％、25％、10％的相对湿度，将0.2％板栗汁孢子悬浮液(15×40倍视野镜下10～20个孢子)滴于凹玻片上，分别放置于上述不同相对湿度的干燥器中，25℃恒温培养，18 h后观察其萌发率，每处理重复4次。
2 结果与分析
2.1 不同培养基对菌丝生长的影响
试验结果(图1)表明，菌丝在PSA、PSA板栗汁和燕麦马铃薯培养基上生长120 h，平均直径分别为88.0、85.3、85.1mm，三者差异不显著。在PSA培养基上，菌丝较致密，菌落突起，呈白色絮状，生长旺盛；其次是PSA板栗汁和燕麦马铃薯培养基。在玉米培养基上，虽菌丝扩展直径小于前3种培养基，但菌丝致密，菌落厚而突起明显。呈白色絮状，生长健壮。菌丝生长最差的是在燕麦培养基上。
2.2 不同温度对菌丝生长的影响
菌株在5～35℃范围内都能生长，20～30℃生长最快，菌丝生长的最适温度为25~C，低于10℃菌丝生长极差，高于35℃不生长，说明该菌适宜相对中温环境。分生孢子在10～40℃均能萌发，适宜温度为15～35℃，最适温度为20～30℃，15℃以下35℃以上分生孢子的萌发率很低(图2)。
2.3 不同pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响
菌丝在pH值3～9均能生长，最适pH值5～6。分生孢子在pH值3～10的溶液中均可萌发，酸性条件有利于孢子萌发，pH值4～7分生孢子萌发率维持在较高水平，萌发最适pH值为5，当溶液变为碱性时(pH值8)，萌发率降低(图3)。
2.4 不同碳源对菌丝生长的影响
在8种供试碳源中，该菌在甘露醇、麦芽糖、甘油、果糖、木糖、淀粉、葡萄糖上均生长良好，且差异不大，以葡萄糖为较优，在蔗糖中生长较差(图4)。由此可见，该菌对碳源的适应性较强。
2.5 不同氮源对菌丝生长的影响
不同氮源对菌丝生长的影响有一定差别，最适氮源为氯化铵和甘氨酸，其次为酵母。菌丝在硝酸钾、硝酸钠、天冬酰胺、蛋白胨4种氮源中生长差异不显著(图5)。
2.6 不同营养成分对孢子萌发的影响
Beckman等(1983)报道，营养能抑制分生孢子的萌发和芽管的伸长。试验表明，分生孢子在清水及4种营养液中均可以直接萌发，说明分生孢子萌发不需要营养，而葡萄糖对孢子萌发有抑制作用(图6)。
2.7 不同湿度对孢子萌发的影响
在相对湿度(RH)85％时孢子萌发率最高，达到87.4％。相对湿度低于或高于85％，孢子萌发率均下降，低于50％时孢子不能萌发，在饱和湿度下孢子萌发率为67.3％(图7)。
3 结论
通过对板栗褐缘叶枯病病原菌的生物学特性研究得出，病原菌对营养的要求不严格，在多种培养基上均能生长良好，以PSA、PSA板栗汁和燕麦马铃薯培养基最为适合；菌丝生长的适宜温度为20～30℃，最适pH值为5～6；该菌对不同碳源和氮源利用率均较高，碳源以葡萄糖为较优，氮源以氯化铵和甘氨酸为最佳。
病原菌分生孢子萌发对营养的需求低。在清水及多种营养液中均可以直接萌发；分生孢子在10～40℃均能萌发，适宜温度为15～35℃，最适温度为20～30℃；在相对湿度85％时孢子萌发率最高，低于或高于85％，孢子萌发率均下降，相对湿度低于50％孢子不能萌发；酸性条件有利于孢子萌发，pH值4～7分生孢子萌发率维持在较高水平，萌发最适pH值为5。
关键词：板栗褐缘叶枯病；病原菌；生物学特性
中图分类号：Q949.32 文献标识号：A 文章编号：1001－4942(2010)04－0052－04
板栗是山东重要的干果产品之一。自2004年以来，在山东泰安、济南、潍坊、临沂等几个板栗产区相继发生了一种新的叶部病害——板栗褐缘叶枯病(Phomopsis mollissima Y.Z.Hua＆S.X.Jiang)，该病的主要症状为板栗叶片上初期产生褐色斑点，随后病斑迅速扩大，呈不规则大面积干枯。病叶9月中、下旬开始大量落叶，10月中、下旬二次发芽抽梢，新发枝梢冬季枯死，又极易诱发板栗疫病，引起林木整株死亡。近几年来，该病发生面积逐年扩大，危害程度逐年加重，给各地板栗树生长和产量均造成了不同程度的危害和损失。如泰安市徂徕山林场2005年十年生板栗树死亡800余株，2006年死亡9000余株，减产近15×10kg。根据目前国内外发表的有关板栗叶斑病类的文献，均没有对该病害的报道。2007年开始，作者对其病原及生物学特性、发病规律及防治方法进行了系统的研究。本试验对该病原菌的生物学特性进行了研究，以期为该病害的防治提供理论基础与技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：板栗褐缘叶枯病叶采自泰安市徂徕山林场光化寺林区。采带有病斑的新鲜板栗叶片，在病斑的病健交界处进行组织分离。按柯赫氏法则进行致病性测定，经过对病原菌形态学和分子生物学鉴定后，单孢分离，保存于4℃冰箱中备用。
供试孢子：将病原菌菌饼接种到PSA板栗汁培养基上，在25℃恒温条件下培养，12d左右在呈灰褐色菌落上开始产生载孢体，载孢体25℃条件下培养40 d左右产生成熟的甲、乙型分生孢子，在15～25℃变温、散色光的条件下易破裂，释放出成团的桔黄色黏稠状溢出物，即甲型孢子，作为本次试验所用孢子。
1.2 研究方法
1.2.1 不同培养基对菌丝生长的影响
选用PSA培养基(马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾5 g、清水1 000 m1)、PSA板栗汁培养基(马铃薯200 g、板栗汁5 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾5 g、清水1 000 ml)、燕麦培养基(燕麦30 g、琼脂25 g、清水1000 ml)、燕麦马铃薯培养基(马铃薯200 g、燕麦30 g、硫酸镁20 g、琼脂20 g、蔗糖20 g、清水1 000 ml)、玉米培养基(玉米粉50 g、琼脂10 g、清水1 000 m1)5种培养基，以清水琼脂培养基为对照。将病原菌沿菌落边缘取直径5 mm的菌饼移植到培养基平板中央，25℃恒温培养，于接种后的第72、96、120 h用十字交叉法测量菌落直径，并计算平均值。每个处理重复4次。
1.2.2 不同温度对菌丝生长和孢子萌发的影响
将病原菌沿菌落边缘取直径5 mm的菌饼移植到PSA板栗汁培养基平板中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃等7个不同温度梯度下培养，于接种后120 h测量菌落直径，每个处理重复4次。以pH 6的0.2％板栗汁配制孢子悬浮液(15×40倍视野镜下10～20个孢子)，滴于凹玻片上，分别放置于10、15、20、25、30、35、40℃下进行培养，18 h后观察其萌发率，每处理重复4次。
1.2.3 不同pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响将板栗汁PSA培养基灭菌后用灭菌的NaOH和HCl分别调pH值至2、3、4、5、6、7、8、9，然后制成平板。接5 into的菌饼后，在25℃温度下恒温箱中培养，于接种后120 h测量菌落直径，每个处理重复4次。配置0，2％板栗汁孢子液(10×40倍视野镜下10~20个孢子)，以1 mol/L NaOH和HCI调节溶液，形成pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的梯度。用载玻片孢子萌发法，将孢子液滴于凹玻片上，放置在25％培养箱中，18 h后观察其萌发率。每处理重复4次。
1.2.4 不同碳源对菌丝生长的影响基本培养基为PDA板栗汁培养基(马铃薯200 g、板栗汁5 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾5 g、水1000 ml)，以2％葡萄糖为碳源，分别以相同含碳量的蔗糖、木糖、果糖、淀粉、甘露醇、麦芽糖、甘油替换葡萄糖，配制成含有不同碳源的培养基。以清水琼脂培养基为对照。从病原菌菌落边缘取直径5 mm的菌饼，分别接种到上述不同碳源的培养基上，置于25℃下恒温箱中培养，于接种后48、96 h测量菌落直径，每个处理重复4次。
1.2.5 不同氮源对菌丝生长的影响基本培养基为PSA板栗汁培养基(马铃薯200 g、板栗叶5 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、硝酸钠2 g、磷酸二氢钾5 g、水1000 m1)，以硝酸钠为氮源，分别以相同含氮量的蛋白胨、甘氨酸、氯化铵、硝酸钾、酵母、天冬酰胺替代硝酸钠，配制成含有不同氮源的培养基。其它方法同1.2.4。
1.2.6 不同营养成分对孢子萌发的影响
采用载玻片孢子萌发法，用0.5％板栗汁、0.2％蔗糖、0.2％葡萄糖、0.2％马铃薯汁及无菌水分别配制一定浓度(15×40倍视野镜下10～20个孢子)的孢子悬浮液，各取一滴滴在凹玻片上，放置在25℃培养箱中培养18 h后观察其萌发率，每处理重复4次。
1.2.7 不同湿度对孢子萌发的影响在干燥器内用不同浓度的硫酸调制成90％、85％、75％、65％、50％、25％、10％的相对湿度，将0.2％板栗汁孢子悬浮液(15×40倍视野镜下10～20个孢子)滴于凹玻片上，分别放置于上述不同相对湿度的干燥器中，25℃恒温培养，18 h后观察其萌发率，每处理重复4次。
2 结果与分析
2.1 不同培养基对菌丝生长的影响
试验结果(图1)表明，菌丝在PSA、PSA板栗汁和燕麦马铃薯培养基上生长120 h，平均直径分别为88.0、85.3、85.1mm，三者差异不显著。在PSA培养基上，菌丝较致密，菌落突起，呈白色絮状，生长旺盛；其次是PSA板栗汁和燕麦马铃薯培养基。在玉米培养基上，虽菌丝扩展直径小于前3种培养基，但菌丝致密，菌落厚而突起明显。呈白色絮状，生长健壮。菌丝生长最差的是在燕麦培养基上。
2.2 不同温度对菌丝生长的影响
菌株在5～35℃范围内都能生长，20～30℃生长最快，菌丝生长的最适温度为25~C，低于10℃菌丝生长极差，高于35℃不生长，说明该菌适宜相对中温环境。分生孢子在10～40℃均能萌发，适宜温度为15～35℃，最适温度为20～30℃，15℃以下35℃以上分生孢子的萌发率很低(图2)。
2.3 不同pH值对菌丝生长和孢子萌发的影响
菌丝在pH值3～9均能生长，最适pH值5～6。分生孢子在pH值3～10的溶液中均可萌发，酸性条件有利于孢子萌发，pH值4～7分生孢子萌发率维持在较高水平，萌发最适pH值为5，当溶液变为碱性时(pH值8)，萌发率降低(图3)。
2.4 不同碳源对菌丝生长的影响
在8种供试碳源中，该菌在甘露醇、麦芽糖、甘油、果糖、木糖、淀粉、葡萄糖上均生长良好，且差异不大，以葡萄糖为较优，在蔗糖中生长较差(图4)。由此可见，该菌对碳源的适应性较强。
2.5 不同氮源对菌丝生长的影响
不同氮源对菌丝生长的影响有一定差别，最适氮源为氯化铵和甘氨酸，其次为酵母。菌丝在硝酸钾、硝酸钠、天冬酰胺、蛋白胨4种氮源中生长差异不显著(图5)。
2.6 不同营养成分对孢子萌发的影响
Beckman等(1983)报道，营养能抑制分生孢子的萌发和芽管的伸长。试验表明，分生孢子在清水及4种营养液中均可以直接萌发，说明分生孢子萌发不需要营养，而葡萄糖对孢子萌发有抑制作用(图6)。
2.7 不同湿度对孢子萌发的影响
在相对湿度(RH)85％时孢子萌发率最高，达到87.4％。相对湿度低于或高于85％，孢子萌发率均下降，低于50％时孢子不能萌发，在饱和湿度下孢子萌发率为67.3％(图7)。
3 结论
通过对板栗褐缘叶枯病病原菌的生物学特性研究得出，病原菌对营养的要求不严格，在多种培养基上均能生长良好，以PSA、PSA板栗汁和燕麦马铃薯培养基最为适合；菌丝生长的适宜温度为20～30℃，最适pH值为5～6；该菌对不同碳源和氮源利用率均较高，碳源以葡萄糖为较优，氮源以氯化铵和甘氨酸为最佳。
病原菌分生孢子萌发对营养的需求低。在清水及多种营养液中均可以直接萌发；分生孢子在10～40℃均能萌发，适宜温度为15～35℃，最适温度为20～30℃；在相对湿度85％时孢子萌发率最高，低于或高于85％，孢子萌发率均下降，相对湿度低于50％孢子不能萌发；酸性条件有利于孢子萌发，pH值4～7分生孢子萌发率维持在较高水平，萌发最适pH值为5。