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为建立一种快速鉴别诊断鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的方法，试验针对鸡毒支原体pvpA基因和鸡滑液囊支原体vlhA基因保守序列，分别设计引物和TaqMan-MGB探针；人工合成包含荧光PCR扩增目的基因的序列，并与载体连接后构建重组质粒MG-pvpA和MSvlhA，测序正确后作为标准质粒；优化反应条件建立了MG和MS的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方法，对方法的敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果显示，该方法特异性良好，与其他常见鸡病原不发生交叉反应，检测MG-pvpA、MS-vlhA的灵敏度分别达到1.58×10~1拷贝/μL、1.21×10~1拷贝/μL，批内与批间的变异系数均小于2%，从36份临床样品中分别检出MG和MS阳性样品11份、8份，与商品荧光PCR试剂盒符合率达到100%。研究表明建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR方法特异性强、重复性好、敏感性高，可用于检测临床样品，快速准确地鉴别MG和MS，有利于支原体在鸡群中的监测和净化。