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摘要 为了研究克氏原螯虾 LC3 基因的序列及其生物信息学，分离并提取肝胰腺组织，并克隆了其 LC3 基因ORF全长序列。结果表明，克氏原螯虾 LC3 基因ORF序列片段为369 bp，编码122个氨基酸。结构分析显示， LC3 基因存在2个结构域，证明了 LC3 基因在细胞自噬中存在多种功能。序列比对及系统进化树分析表明，克氏原螯虾与节肢动物进化关系最接近，其 LC3 基因序列具有节肢动物的典型特征，在进化过程中保守性较高。荧光定量PCR显示，克氏原螯虾 LC3 基因在肝胰腺中表达水平最高，与肠道相比有显著差异（ P <0.05），与心脏和肌肉无显著差异（ P >0.05）;心脏和肌肉中 LC3 基因的表达量次之，但与肠道相比差异显著（ P <0.05）;肠道中 LC3 表达量最低。该研究结果可为深入研究 LC3 基因表达与动物营养调控提供基础依据和参考。
关键词 克氏原螯虾; LC3 基因;基因克隆;组织特异性表达
中图分类号 S 917.4 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）19-0086-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.021
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Cloning and Tissue-specific Expression of LC3 Gene in Procambarus clarkii
ZHU Jian-qiang，XU Wen-jie，XU Wen-cheng et al
（Yancheng Institute of Technology，Yancheng，Jiangsu 224051）
Abstract In order to study the sequence of LC3 gene and its bioinformatics of Procambarus clarkii， hepatopancreas tissue was isolated and extracted，the full-length ORF sequence of LC3 gene was cloned.The results showed that the ORF sequence fragment of the LC3 gene of P.clarkii was 369 bp，encoding 122 amino acids.Structural analysis showed that the LC3 gene had two domains，proving that the LC3 gene had multiple functions in autophagy.Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that P.clarkii had the closest evolutionary with arthropods，and its LC3 gene sequence had typical arthropod characteristics and it was highly conserved during evolution.Fluorescence quantitative PCR showed that P.clarkii LC3 gene was expressed at the highest level in the hepatopancreas，and it was significantly different from the intestine （ P< 0.05），but it was not significantly different from the heart and muscle （ P >0.05）;the muscle expression was the second，but it was still significantly different from the intestine （ P< 0.05）;the expression of LC3 in the intestine was the lowest.The research results could provide basic basis and reference for in-depth study on LC3 gene expression and animal nutrition regulation.
Key words Procambarus clarkii;LC3 gene;Gene cloning;Tissue-specific expression
基金项目 2020年大学生创新创业训练计划立项项目（2020088）;江苏省苏北科技专项（SZ-YC2018039）。
作者简介 朱健强（1998—），男，江苏扬州人，硕士研究生，研究方向：水产动物营养与饲料科学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事水产动物营养与饲料研究。
收稿日期 2021-01-30
LC3又称微管相关蛋白轻链3 （microtubule-associated protein light chain 3，简称LC3），是细胞自噬过程中最重要的标志性自噬蛋白分子，它最初是1987年由2位外国科学家将从牛脑细胞组织中提取出的微管相關蛋白组分纯化电泳后发现的[1]。黄天晴等[2]克隆了三倍体虹鳟（ Oncorhynchus mykiss ）的 LC3 基因序列，其进化树分析表明虹鳟 LC3 基因在进化过程中保守性高，与大西洋鲑（ Salmo salar ） LC3 基因进化关系最近。余振兴等[3]为研究水生贝类的细胞自噬过程，利用扩增的紫贻贝（ Mytilus edulis） LC3 B基因构建重组表达载体，转化后得到 LC3 B基因多克隆抗体。为了能够更深入研究细胞自噬的发生过程、作用机制以及 LC3 基因在动物体器官或细胞中的表达及功能，科研人员对多种动物的 LC3 基因进行了表达与定位研究。哺乳动物方面，郭燕君等[4]研究了 LC3 基因在小鼠 （Mus musculus） 卵泡颗粒细胞中的定位与表达，研究发现无论小鼠卵泡在哪一种发育阶段， LC3 基因都主要在卵泡颗粒细胞中表达。雷薇等[5]研究发现 LC3 基因在幼年水牛心脏、肝脏等不同组织以及成年水牛卵巢中都有不同程度的表达。 克氏原螯虾 （Procambarus clarkii ）隶属甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）螯虾科（Cambaridae），是一种适应性强、分布广、生长快、繁殖率高、食性杂的淡水虾类，不仅是淡水渔业资源的重要组成部分，而且还被用作环境科学、营养学、药理学研究的模式动物[6]。目前， LC3 基因在哺乳动物等领域中应用较多，但在水生动物方面研究较少，其中关于克氏原螯虾 LC3 基因的克隆、序列分析未见报道。笔者对克氏原螯虾 LC3 基因进行克隆、序列分析及组织特异性表达，构建克氏原螯虾 LC3 基因系统进化树，并对 LC3 基因在不同组织中的特异性表达深入研究，旨在为今后探究 LC3 基因表达与动物营养的关系、影响 LC3 基因表达水平的因素等提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从湖南长沙光华科技有限公司挑选近20只健康活泼、附肢完整且规格一致的克氏原螯虾，体重为（31.00±0.05）g。取样时在有冰袋降温的解剖盘上剪取虾的肠道、肝胰腺、肌肉、心脏组织，装入1.5 mL离心管中，快速将其放于液氮罐中，再放入-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 总RNA提取与cDNA第一链合成
克氏原螯虾肝胰腺组织总RNA的提取参照Trizol试剂盒的说明书。肝胰腺组织总RNA完整度和纯度的检测使用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸测定仪。然后，参照Fermentas公司的逆转录试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）说明书合成cDNA，并置于-20 ℃冰箱中保存备用。
B548F1（primer F）和B548R0（primer R）的序列分别为5′-ATGAACAACCAAGCCAAG-3′和5′-GGCAAGATCATTGTCCAA-3′;LC3- F和LC3-R的序列分别为5′-ACGGAAGTTACATCGTTTAGCAG-3′和5′-CATAACTTGGCGGTTTGTCC-3′。
1.3 LC3 基因ORF全长扩增
根据克氏原螯虾转录组预测的 LC3 基因，使用Primer Premier 5.0设计引物扩增克氏原螯虾的 LC3 基因，然后将引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ORF扩增体系以克氏原螯虾cDNA为模板，加入5.0 μL cDNA第一链、15.0 μL PCR-Grade Water、25.0 μL 2×Ex taq Buffer（TaKaRa）、1.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1.0 μL Ex taq（TaKaRa）、1.5 μL primer F（10×）、1.5 μL primer R（10×）。PCR扩增程序如下：94 ℃下预变性2 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环;72 ℃下延伸10 min后反应结束。将反应结束后得到的PCR产物进行电泳回收和连接转化，依据电泳图检测的DNA条带大小，选择符合要求的阳性克隆菌液进行测序。
1.4 序列分析及构建系统进化树
利用NCBI网站氨基酸数据库的Blast功能，查阅相关物种 LC3 基因编码的氨基酸序列及序列号，通过MEGA 6.0软件将查阅下载的氨基酸数据导入，以Neighbor-joining法构建克氏原螯虾与其他不同物种的 LC3 氨基酸序列的系统进化树，分析克氏原螯虾 LC3 基因的进化情况。使用SMART软件分析克氏原螯虾 LC3 基因编码的蛋白质结构域及其相关功能。运用DNAMAN软件对克氏原螯虾 LC3 基因序列进行氨基酸翻译对照，并将克氏原螯虾 LC3 基因的氨基酸序列与其他不同物种之间进行多重序列比对。
1.5 荧光定量PCR检测 LC3 组织特异性表达
使用TRizol试剂提取正常克氏原螯虾肠道、肝胰腺、肌肉和心脏组织的总RNA，cDNA合成參照IScriptTM cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）试剂盒说明书。以合成的25 μL cDNA经10倍稀释后作为模板，按照以下参数配制20 μL PCR扩增体系：10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×），0.5 μL上下游引物，5.0 μL cDNA模板，9.0 μL ddH 2O。使用实时荧光定量扩增仪按以下参数进行PCR扩增：95℃变性60 s;95℃，5 s，58 ℃，25 s，40个循环。
1.6 数据处理及分析 LC3 基因的相对表达量用2-ΔΔCt法计算，试验数据均以算数平均值±标准误表示。所有统计数据均使用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan法进行差异显著性分析， P< 0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 克氏原螯虾 LC3 基因序列分析 以克氏原螯虾 LC3 基因的cDNA为模板，利用PCR方法扩增其 LC3 基因ORF片段。DNA电泳结果显示一条约400 bp的片段，经过测序最终得到克氏原螯虾 LC3 基因ORF全长序列。通过NCBI网站对克氏原螯虾 LC3 基因的ORF序列进行分析，结果发现其ORF序列全长369 bp，可编码122个氨基酸。利用Blast程序对克氏原螯虾与其他物种的 LC3 基因ORF序列进行比对，结果显示此次测定的基因序列与NCBI网站中的 LC3 基因的一致性和相似性较高，其编码的氨基酸序列与甲壳类动物 LC3 基因的氨基酸序列相似性也较高，因而确定此次测定的基因序列为克氏原螯虾 LC3 基因ORF序列。该基因序列已提交到GenBank数据库，获得登录号 NW186828。 通用SMART软件分析克氏原螯虾 LC3 基因编码的蛋白质结构域及其相关功能，结果显示 LC3 基因编码蛋白质具有2个结构域，分别为ATG8（自噬相关蛋白8，autophagy related gene 8，简称ATG8）和 APG12（自噬相关蛋白12抗体，autophagy related protein 12，简称APG12）（图1）。
2.2 克氏原螯虾 LC3 基因编码的氨基酸序列同源性及进化树分析
利用NCBI网站的BLAST程序对克氏原螯虾与其他物种的 LC3 基因进行氨基酸序列分析，结果表明克氏原螯虾与南美白对虾相似性最高，达到95%;三疣梭子蟹次之，达到94%，其他物种的相似性为66%～75%。通过DNAMAN软件将克氏原螯虾 LC3 基因的氨基酸序列与这些物种进行多重序列比对，比对分析显示（图2）克氏原螯虾 LC3 基因氨基酸序列与南美白对虾、大西洋马蹄蟹和亚利桑那树皮蝎具有较高的相似性，而与鱼类、哺乳动物、两栖动物序列相似性较低。结果表明， LC3 基因所编码的氨基酸序列高度保守，同时克氏原螯虾 LC3 基因序列具有十分典型的节肢动物特征。系统进化树结果显示（图3），克氏原螯虾 LC3 基因与节肢动物聚为一个分支，与南美白对虾的遗传距离最近。
2.3 克氏原螯虾 LC3 基因的组织特性表达
使用SPSS 24.0软件进行单因素分析，分析 LC3 基因在克氏原螯虾各个组织中的表达水平。结果表明（图4）， LC3 基因在克氏原螯虾4个组织中均有不同程度的表达。其中，克氏原螯虾肝胰腺中 LC3 基因的表达量最高，心脏和肌肉中 LC3 基因相对表达量较低，肠道的基因表达量最低。Duncan检验结果显示， LC3 基因在肝胰腺和肠道中的表达水平差异显著（ P< 0.05）;肝胰腺与心脏和肌肉组织相比 LC3 基因的表达水平无显著差异（ P> 0.05）;心脏与肌肉和肠道组织相比 LC3 基因的表达水平有显著差异（ P <0.05）。
3 讨论
LC3是细胞自噬过程最重要的标志性蛋白分子，最早在酵母细胞中被发现，其主要功能与作用包括自噬体的生成、溶酶体的起始与成熟、不同自噬底物的降解清除等。当机体受到病原物侵袭后，生命体会诱导细胞中 LC3 基因的表达为自噬过程服务，清除一些被病原体破坏的细胞、大分子物质等[1，7-8]。已有研究表明大鼠[9]、水牛[5]、荷包红鲤[10]、三倍体虹鳟[2]、紫贻贝[3]、黄颡鱼[11]的ORF序列长度分别为380、499、378、378、370和366 bp。已有的研究结果与此次测定的克氏原螯虾 LC3 基因ORF序列具有相似的碱基长度。
ATG8和APG12本身就是与细胞自噬过程密切相关的功能蛋白质，其中 LC3 基因是ATG8蛋白家族的同源形式之一[12]。该研究结果表明，克氏原螯虾 LC3 基因所编码蛋白质的2个结构域介于蛋白质二级与三级结构之间，这是 LC3 基因编码蛋白质中相对独立、稳定的区域。ATG8和APG12占有一定的氨基酸序列，是 LC3 基因发挥其在自噬过程中功能的基础。另外， LC3 基因有2个结构域，不同结构域通常对应不同的功能，这说明 LC3 基因在自噬过程中起到的作用比较多样[13-14]。
多重序列比对表明，克氏原螯虾与南美白对虾、大西洋马蹄蟹和亚利桑那树皮蝎的同源性非常高，克氏原螯虾 LC3 基因序列具有典型的节肢动物特征。克氏原螯虾保守序列相对较多，推测其在进化过程中可能较为保守。系统进化树分析表明亲缘关系越近的物种，其 LC3 基因序列的同源性也越高。克氏原螯虾与南美白对虾、大西洋马蹄蟹、亚利桑那树皮蝎的进化关系较近，说明克氏原螯虾在进化过程中有着非常稳定的途径，基因突变较少，它们都来自同一个祖先，进化过程中保守性较高。
该试验中 LC3 基因在各组织中均有表达，这种表达模式与鱼类相一致，例如在荷花红鲤中 LC3 B在肌肉、鳃、脾、肝、肾、心等组织中均有表达[10]。该研究表明克氏原螯虾的肝胰腺组织中 LC3 的表达量最高。魏晓雷等[15]对黄颡鱼自噬相关基因 LC3 B和 Beclin1 的原核表达及多克隆抗体制备的研究中也同样发现 LC3 在黄颡鱼的肝胰腺组织中有较高的表达，与该研究结果基本一致。因此可推测克氏原螯虾的肝胰腺是自噬发生的主要场所，当机体面临环境等应激时，组织中的 LC3 -Ⅰ会迅速转化为 LC3 -Ⅱ，从而产生自噬来维持机体内稳态机制的平衡。
参考文献
[1]
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[4] 郭燕君，徐营，刘胜兵，等.LC3蛋白在小鼠卵泡颗粒细胞中的表达及定位研究[J].中国病理生理杂志，2017，33（9）：1690-1695.
[5] 雷薇，李卉，粟小平，等.水牛自噬相关基因克隆、序列分析及组织表达研究[J].黑龙江畜牧兽医，2015（23）：14-17.
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[13] 倪志华，刘阿显，杨会然，等.自噬标志分子ATG8同源蛋白的生物信息[J].基因组学与应用生物学，2019，38（5）：1949-1956.
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[15] 魏晓雷，叶汉梅，罗智.黄颡鱼自噬相关基因LC3B和Beclin1的原核表达及多克隆抗体制备[J].水生生物学报，2019，43（6）：1197-1202.
关键词 克氏原螯虾; LC3 基因;基因克隆;组织特异性表达
中图分类号 S 917.4 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）19-0086-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.021
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Cloning and Tissue-specific Expression of LC3 Gene in Procambarus clarkii
ZHU Jian-qiang，XU Wen-jie，XU Wen-cheng et al
（Yancheng Institute of Technology，Yancheng，Jiangsu 224051）
Abstract In order to study the sequence of LC3 gene and its bioinformatics of Procambarus clarkii， hepatopancreas tissue was isolated and extracted，the full-length ORF sequence of LC3 gene was cloned.The results showed that the ORF sequence fragment of the LC3 gene of P.clarkii was 369 bp，encoding 122 amino acids.Structural analysis showed that the LC3 gene had two domains，proving that the LC3 gene had multiple functions in autophagy.Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that P.clarkii had the closest evolutionary with arthropods，and its LC3 gene sequence had typical arthropod characteristics and it was highly conserved during evolution.Fluorescence quantitative PCR showed that P.clarkii LC3 gene was expressed at the highest level in the hepatopancreas，and it was significantly different from the intestine （ P< 0.05），but it was not significantly different from the heart and muscle （ P >0.05）;the muscle expression was the second，but it was still significantly different from the intestine （ P< 0.05）;the expression of LC3 in the intestine was the lowest.The research results could provide basic basis and reference for in-depth study on LC3 gene expression and animal nutrition regulation.
Key words Procambarus clarkii;LC3 gene;Gene cloning;Tissue-specific expression
基金项目 2020年大学生创新创业训练计划立项项目（2020088）;江苏省苏北科技专项（SZ-YC2018039）。
作者简介 朱健强（1998—），男，江苏扬州人，硕士研究生，研究方向：水产动物营养与饲料科学。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事水产动物营养与饲料研究。
收稿日期 2021-01-30
LC3又称微管相关蛋白轻链3 （microtubule-associated protein light chain 3，简称LC3），是细胞自噬过程中最重要的标志性自噬蛋白分子，它最初是1987年由2位外国科学家将从牛脑细胞组织中提取出的微管相關蛋白组分纯化电泳后发现的[1]。黄天晴等[2]克隆了三倍体虹鳟（ Oncorhynchus mykiss ）的 LC3 基因序列，其进化树分析表明虹鳟 LC3 基因在进化过程中保守性高，与大西洋鲑（ Salmo salar ） LC3 基因进化关系最近。余振兴等[3]为研究水生贝类的细胞自噬过程，利用扩增的紫贻贝（ Mytilus edulis） LC3 B基因构建重组表达载体，转化后得到 LC3 B基因多克隆抗体。为了能够更深入研究细胞自噬的发生过程、作用机制以及 LC3 基因在动物体器官或细胞中的表达及功能，科研人员对多种动物的 LC3 基因进行了表达与定位研究。哺乳动物方面，郭燕君等[4]研究了 LC3 基因在小鼠 （Mus musculus） 卵泡颗粒细胞中的定位与表达，研究发现无论小鼠卵泡在哪一种发育阶段， LC3 基因都主要在卵泡颗粒细胞中表达。雷薇等[5]研究发现 LC3 基因在幼年水牛心脏、肝脏等不同组织以及成年水牛卵巢中都有不同程度的表达。 克氏原螯虾 （Procambarus clarkii ）隶属甲壳纲（Crustacea）十足目（Decapoda）螯虾科（Cambaridae），是一种适应性强、分布广、生长快、繁殖率高、食性杂的淡水虾类，不仅是淡水渔业资源的重要组成部分，而且还被用作环境科学、营养学、药理学研究的模式动物[6]。目前， LC3 基因在哺乳动物等领域中应用较多，但在水生动物方面研究较少，其中关于克氏原螯虾 LC3 基因的克隆、序列分析未见报道。笔者对克氏原螯虾 LC3 基因进行克隆、序列分析及组织特异性表达，构建克氏原螯虾 LC3 基因系统进化树，并对 LC3 基因在不同组织中的特异性表达深入研究，旨在为今后探究 LC3 基因表达与动物营养的关系、影响 LC3 基因表达水平的因素等提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从湖南长沙光华科技有限公司挑选近20只健康活泼、附肢完整且规格一致的克氏原螯虾，体重为（31.00±0.05）g。取样时在有冰袋降温的解剖盘上剪取虾的肠道、肝胰腺、肌肉、心脏组织，装入1.5 mL离心管中，快速将其放于液氮罐中，再放入-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 总RNA提取与cDNA第一链合成
克氏原螯虾肝胰腺组织总RNA的提取参照Trizol试剂盒的说明书。肝胰腺组织总RNA完整度和纯度的检测使用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸测定仪。然后，参照Fermentas公司的逆转录试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）说明书合成cDNA，并置于-20 ℃冰箱中保存备用。
B548F1（primer F）和B548R0（primer R）的序列分别为5′-ATGAACAACCAAGCCAAG-3′和5′-GGCAAGATCATTGTCCAA-3′;LC3- F和LC3-R的序列分别为5′-ACGGAAGTTACATCGTTTAGCAG-3′和5′-CATAACTTGGCGGTTTGTCC-3′。
1.3 LC3 基因ORF全长扩增
根据克氏原螯虾转录组预测的 LC3 基因，使用Primer Premier 5.0设计引物扩增克氏原螯虾的 LC3 基因，然后将引物送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ORF扩增体系以克氏原螯虾cDNA为模板，加入5.0 μL cDNA第一链、15.0 μL PCR-Grade Water、25.0 μL 2×Ex taq Buffer（TaKaRa）、1.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1.0 μL Ex taq（TaKaRa）、1.5 μL primer F（10×）、1.5 μL primer R（10×）。PCR扩增程序如下：94 ℃下预变性2 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环;72 ℃下延伸10 min后反应结束。将反应结束后得到的PCR产物进行电泳回收和连接转化，依据电泳图检测的DNA条带大小，选择符合要求的阳性克隆菌液进行测序。
1.4 序列分析及构建系统进化树
利用NCBI网站氨基酸数据库的Blast功能，查阅相关物种 LC3 基因编码的氨基酸序列及序列号，通过MEGA 6.0软件将查阅下载的氨基酸数据导入，以Neighbor-joining法构建克氏原螯虾与其他不同物种的 LC3 氨基酸序列的系统进化树，分析克氏原螯虾 LC3 基因的进化情况。使用SMART软件分析克氏原螯虾 LC3 基因编码的蛋白质结构域及其相关功能。运用DNAMAN软件对克氏原螯虾 LC3 基因序列进行氨基酸翻译对照，并将克氏原螯虾 LC3 基因的氨基酸序列与其他不同物种之间进行多重序列比对。
1.5 荧光定量PCR检测 LC3 组织特异性表达
使用TRizol试剂提取正常克氏原螯虾肠道、肝胰腺、肌肉和心脏组织的总RNA，cDNA合成參照IScriptTM cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad）试剂盒说明书。以合成的25 μL cDNA经10倍稀释后作为模板，按照以下参数配制20 μL PCR扩增体系：10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×），0.5 μL上下游引物，5.0 μL cDNA模板，9.0 μL ddH 2O。使用实时荧光定量扩增仪按以下参数进行PCR扩增：95℃变性60 s;95℃，5 s，58 ℃，25 s，40个循环。
1.6 数据处理及分析 LC3 基因的相对表达量用2-ΔΔCt法计算，试验数据均以算数平均值±标准误表示。所有统计数据均使用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan法进行差异显著性分析， P< 0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 克氏原螯虾 LC3 基因序列分析 以克氏原螯虾 LC3 基因的cDNA为模板，利用PCR方法扩增其 LC3 基因ORF片段。DNA电泳结果显示一条约400 bp的片段，经过测序最终得到克氏原螯虾 LC3 基因ORF全长序列。通过NCBI网站对克氏原螯虾 LC3 基因的ORF序列进行分析，结果发现其ORF序列全长369 bp，可编码122个氨基酸。利用Blast程序对克氏原螯虾与其他物种的 LC3 基因ORF序列进行比对，结果显示此次测定的基因序列与NCBI网站中的 LC3 基因的一致性和相似性较高，其编码的氨基酸序列与甲壳类动物 LC3 基因的氨基酸序列相似性也较高，因而确定此次测定的基因序列为克氏原螯虾 LC3 基因ORF序列。该基因序列已提交到GenBank数据库，获得登录号 NW186828。 通用SMART软件分析克氏原螯虾 LC3 基因编码的蛋白质结构域及其相关功能，结果显示 LC3 基因编码蛋白质具有2个结构域，分别为ATG8（自噬相关蛋白8，autophagy related gene 8，简称ATG8）和 APG12（自噬相关蛋白12抗体，autophagy related protein 12，简称APG12）（图1）。
2.2 克氏原螯虾 LC3 基因编码的氨基酸序列同源性及进化树分析
利用NCBI网站的BLAST程序对克氏原螯虾与其他物种的 LC3 基因进行氨基酸序列分析，结果表明克氏原螯虾与南美白对虾相似性最高，达到95%;三疣梭子蟹次之，达到94%，其他物种的相似性为66%～75%。通过DNAMAN软件将克氏原螯虾 LC3 基因的氨基酸序列与这些物种进行多重序列比对，比对分析显示（图2）克氏原螯虾 LC3 基因氨基酸序列与南美白对虾、大西洋马蹄蟹和亚利桑那树皮蝎具有较高的相似性，而与鱼类、哺乳动物、两栖动物序列相似性较低。结果表明， LC3 基因所编码的氨基酸序列高度保守，同时克氏原螯虾 LC3 基因序列具有十分典型的节肢动物特征。系统进化树结果显示（图3），克氏原螯虾 LC3 基因与节肢动物聚为一个分支，与南美白对虾的遗传距离最近。
2.3 克氏原螯虾 LC3 基因的组织特性表达
使用SPSS 24.0软件进行单因素分析，分析 LC3 基因在克氏原螯虾各个组织中的表达水平。结果表明（图4）， LC3 基因在克氏原螯虾4个组织中均有不同程度的表达。其中，克氏原螯虾肝胰腺中 LC3 基因的表达量最高，心脏和肌肉中 LC3 基因相对表达量较低，肠道的基因表达量最低。Duncan检验结果显示， LC3 基因在肝胰腺和肠道中的表达水平差异显著（ P< 0.05）;肝胰腺与心脏和肌肉组织相比 LC3 基因的表达水平无显著差异（ P> 0.05）;心脏与肌肉和肠道组织相比 LC3 基因的表达水平有显著差异（ P <0.05）。
3 讨论
LC3是细胞自噬过程最重要的标志性蛋白分子，最早在酵母细胞中被发现，其主要功能与作用包括自噬体的生成、溶酶体的起始与成熟、不同自噬底物的降解清除等。当机体受到病原物侵袭后，生命体会诱导细胞中 LC3 基因的表达为自噬过程服务，清除一些被病原体破坏的细胞、大分子物质等[1，7-8]。已有研究表明大鼠[9]、水牛[5]、荷包红鲤[10]、三倍体虹鳟[2]、紫贻贝[3]、黄颡鱼[11]的ORF序列长度分别为380、499、378、378、370和366 bp。已有的研究结果与此次测定的克氏原螯虾 LC3 基因ORF序列具有相似的碱基长度。
ATG8和APG12本身就是与细胞自噬过程密切相关的功能蛋白质，其中 LC3 基因是ATG8蛋白家族的同源形式之一[12]。该研究结果表明，克氏原螯虾 LC3 基因所编码蛋白质的2个结构域介于蛋白质二级与三级结构之间，这是 LC3 基因编码蛋白质中相对独立、稳定的区域。ATG8和APG12占有一定的氨基酸序列，是 LC3 基因发挥其在自噬过程中功能的基础。另外， LC3 基因有2个结构域，不同结构域通常对应不同的功能，这说明 LC3 基因在自噬过程中起到的作用比较多样[13-14]。
多重序列比对表明，克氏原螯虾与南美白对虾、大西洋马蹄蟹和亚利桑那树皮蝎的同源性非常高，克氏原螯虾 LC3 基因序列具有典型的节肢动物特征。克氏原螯虾保守序列相对较多，推测其在进化过程中可能较为保守。系统进化树分析表明亲缘关系越近的物种，其 LC3 基因序列的同源性也越高。克氏原螯虾与南美白对虾、大西洋马蹄蟹、亚利桑那树皮蝎的进化关系较近，说明克氏原螯虾在进化过程中有着非常稳定的途径，基因突变较少，它们都来自同一个祖先，进化过程中保守性较高。
该试验中 LC3 基因在各组织中均有表达，这种表达模式与鱼类相一致，例如在荷花红鲤中 LC3 B在肌肉、鳃、脾、肝、肾、心等组织中均有表达[10]。该研究表明克氏原螯虾的肝胰腺组织中 LC3 的表达量最高。魏晓雷等[15]对黄颡鱼自噬相关基因 LC3 B和 Beclin1 的原核表达及多克隆抗体制备的研究中也同样发现 LC3 在黄颡鱼的肝胰腺组织中有较高的表达，与该研究结果基本一致。因此可推测克氏原螯虾的肝胰腺是自噬发生的主要场所，当机体面临环境等应激时，组织中的 LC3 -Ⅰ会迅速转化为 LC3 -Ⅱ，从而产生自噬来维持机体内稳态机制的平衡。
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