高粱PHD-Finger基因家族的鉴定、分类及表达特征分析

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  摘 要:PHD(PHD-Finger)家族基因广泛存在于真核生物中,基因功能广泛。本文在高粱中筛选、鉴定出79个PHD家族成员,对其进行系统发育、蛋白结构域、基因结构、染色体定位、共线性分析和顺式作用元件分析。结果表明,高粱PHD基因在系统发育、蛋白结构域和基因结构上存在较大变异;通过对高粱PHD基因在盐胁迫下,不同品种,不同时期的表达分析,获得1个耐盐候选基因(SORBI_3001G425900),为进一步研究PHD基因在高粱中的功能提供了参考。
  关键词:高粱;PHD;基因家族;表达特征
  中图分类号:S514文献标识码:A
  文章编号:1008-0457(2020)04-0010-11 国际DOI编码:10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.04.002
  Abstract:The plant homeodomain (PHD)-finger family gene are widespread in eukaryotes and have a wide range of functions. In this paper, a total of 79 PHD genes were screened. We also analysed PHD genes phylogenetic, protein domain, gene structure, chromosome location, synteny analysis and cis-acting element analysis. The results revealed that the PHD genes of sorghum displayed a great divergence in phylogenetic, protein domain and gene structure. Expression analysis of sorghum PHD gene at different salt-treatment times in different sorghum variety revealed a candidate gene for salt tolerance (SORBI_3001G425900). This result providesa reference for further studying on the function of PHD genes in sorghum.
  Keywords:sorghum;PHD;gene family;express characteristics
  高粱(Sorghum bicolor)具有极强抗逆性,属禾本科C4植物,在谷类作物中位列世界第五位[1],是我国白酒酿造的主要原料[2]。2009年高粱全基因组测定工作顺利完成,加速了对高粱基因的挖掘和鉴定。
  锌指蛋白是依靠锌离子结合组氨酸和半胱氨酸残基,形成的一类具有稳定结构域的“指状”蛋白[3-4]。锌指蛋白可分为PHD、RING、LIM等多种类型,其区别在于组氨酸和半胱氨酸残基的排列方式,其中PHD-finger蛋白结构域由50到80个氨基酸组成[5-6],虽然PHD(Cys4-His-Cys3)、RING(Cys3-His-Cys4)和LIM(Cys2-His-Cys5)的保守基序极其相似,但是蛋白质的空间结构却相差很大[7-8]。
  随着测序技术的不断成熟,在植物、哺乳动物和线虫中均发现PHD家族基因 [9],表明PHD家族基因广泛存在于生物界中。第一个PHD结构域由Schindler[10]在拟南芥中发现并命名,随后越来越多的PHD家族基因被鉴定,如在大豆、玉米、杨树、梨等植物中分别鉴定出95个、67个、73个、31个PHD家族基因[11-14],目前尚未见高粱PHD家族成员的相关报导。为探究PHD家族成员在高粱中的功能及作用,本文对高粱PHD家族进行全基因组鉴定、分类及表达特征分析,并利用转录组数据,分析高粱PHD家族成员在盐胁迫下的表達情况,为筛选和分析PHD家族基因及其在高粱抗逆中的作用提供参考。
  1 材料与方法
  1.1 高粱PHD家族数据下载和鉴定
  高粱PHD家族基因组数据于Ensembl Plants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)下载得到, PHD家族保守结构域蛋白序列的hmm文件于Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)下载。
  1.2 高粱PHD家族成员筛选、定位及理化性质的预测
  利用Linux系统下的HMM3.0软件筛选高粱中存在PHD家族结构域的蛋白序列,去除重复及不完整的蛋白序列,最终得到高粱PHD家族基因,利用软件MapChart2.32绘制基因染色体分布图。通过在线软件ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析家族基因的氨基酸数目、分子量、等电点以及亲水性等理化性质。
  1.3 高粱PHD系统发育、保守结构域及基因结构分析
  利用同样方法筛选得到谷子PHD基因,将高粱和谷子PHD家族蛋白序列整合到一个FA文件中,利用进化分析软件MEGA7.0进行分析[15],再选择邻接法(Neighbor-Joining)构建PHD家族系统发育树[16]。通过MEME软件对高粱PHD家族成员进行蛋白保守结构域(motif)分析,moiif数目设置为10个,基序长度30~200。利用TBtools软件整合数据绘制高粱PHD家族进化树+保守结构域+基因结构图。
  1.4 共线性分析
  运用Linux系统下McscanX软件对高粱PHD家族成员进行染色体定位,利用Blastp与McscanX软件对高粱基因组信息进行分析,通过Circos将高粱种内基因关系可视化;利用McscanX构建高粱与谷子间的共线性图谱。   1.5 高粱PHD家族基因顺式作用元件
  1.6 高粱PHD家族基因的表达分析
  以0.8%的NaCl分别处理高耐盐品种‘高粱蔗’(GZ)和盐敏感品种‘河农16’(HN16)的三葉期植株,每个处理重复3次,采集处理后0h、48h和72h的整株植株,-80℃保存,Trizol法提取RNA,检测其完整性,将3个重复的RNA进行1:1:1混合,利用Illumina HiSeq 2500对RNA进行高通量测序[17]。分析两个品种在盐胁迫下不同时期PHD家族基因的表达差异,利用TBtools软件将其可视化,分析高粱PHD家族基因在不同盐浓度处理下的表达模式。
  2 结果与分析
  2.1 高粱PHD家族基因鉴定及理化性质分析
  利用PHD的HMM模型对高粱全基因组信息进行鉴定分析,筛选出79个高粱PHD家族成员(表1)。生物信息学分析表明,79个高粱PHD家族基因编码氨基酸数目差异很大,其中SORBI_3010G001100所含氨基酸数目最多,达到2265个;SORBI_3001G335201所含氨基酸数目最少,仅有79个。蛋白质分子量大小介于8665KD(SORBI_3001G335201)~249883.2KD(SORBI_3010G001100)之间。等电点介于4.22(SORBI_3009G115900)~ 9.23(SORBI_3009G056900)之间,平均等电点为6.88。亲水性平均值范围介于-1.147(SORBI_3001G398950)~ 0.162(SORBI_3001G335201),除SORBI_3001G335201的亲水性平均值大于0,其余78个基因均为负值,即为亲水蛋白。
  2.2 PHD 家族基因系统发育、保守基序及基因结构分析
  利用筛选到的66个谷子PHD基因和79个高粱PHD基因构建系统发育树。根据系统发育树,可将PHD家族成员分为6个亚族(图1),每个亚族内的PHD基因有较高的同源性,Group1中含有30个PHD基因,在6个亚族内最多,包括17个高粱PHD基因和13谷子PHD基因;Group2包括12个高粱PHD基因和11个谷子PHD基因;Group3包括13个高粱PHD基因和10个谷子PHD基因;Group4含有包括15个高粱PHD基因和12个谷子PHD基因;Group5和Group6所含PHD基因最少,均包含11个高粱PHD基因和10个谷子PHD基因。
  通过分析高粱PHD家族成员蛋白的保守结构域发现,所有高粱PHD基因均含有(CCCCHCCC)这一保守结构域(图2)。相同亚族内还有较为相似的保守结构域(motif),每个PHD基因都含有至少1个motif2或motif3(图3);不同组间PHD基因保守结构域差异较大,说明高粱种内PHD基因功能保守性较差,其中69个PHD家族基因的内含子普遍较短,10个PHD家族基因无内含子(图4)。
  2.3 高粱PHD家族基因染色体定位
  将高粱PHD家族基因全部定位到染色体(图5),发现79个PHD基因不均匀的分布在高粱10条染色体上,每条染色体上存在5~13个PHD基因,其中2号染色体上分布最多,达13个;5号、6号、7号和8号染色体PHD基因分布最少,仅存在5个。所有染色体上的PHD基因均呈现分散分布,除2号染色体的SORB_3002G14840和SORB_3002G15400位于染色体中间位置外,其余77个基因均位于染色体两端。
  2.4 高粱PHD家族基因共线性分析
  在物种进化和基因功能分化过程中,基因复制发挥着重要作用,是基因家族扩张的主要原因之一。共线性分析结果显示(图6),高粱PHD家族基因成员中存在2对串联重复,和3对基因复制,其中SORBI_3004G182900和SORBI_3006G093200,SORBI_3009G140700和SORBI_3003G382100,SORBI_3002G427100和SORBI_3001G397800存在较多重复。为更好了解高粱PHD家族基因的进化关系,利用KaKs_Calculator软件计算基因对Ka/Ks值,其中SORBI_3002G192500与SORBI_3007G130300的Ka/Ks值小于1,说明该对基因受到纯化选择压力,可能与人类长期定向选择有关。
  通过构建高粱与谷子物种间的关系图谱,发现高粱与谷子的PHD基因存在52条共线性关系(图7),可见高粱与谷子的PHD基因亲缘关系较近。
  2.5 PHD家族顺式作用元件
  截取高粱PHD家族基因上游1500_bp的序列,进行启动子顺式作用元件分析,除了在植物中普遍存在的基本元件CAAT-box和TATA-box外,本文主要分析了有关植物生长发育、激素调节、逆境应答和防御机制等顺式作用元件(图8)。在79个基因中,62个基因含有脱落酸响应元件(ABRE),32个含有干旱诱导响应元件(MBS),69个含有茉莉酸响应相关元件(CGTCA-motif、TGACG-motif);56个含有抗氧化逆境响应元件(ARE),30个含有低温响应元件(LTR);25个具有水杨酸应答元件(TCA-element),18个具有防御及胁迫响应元件(TC-rich);其中24个基因同时具有ABRE、MBS、CGTCA-motif、TGACG-motif这4个顺式作用元件。这些顺式作用元件说明PHD家族基因可能在干旱、低温和盐胁迫等多种逆境下发挥作用[18-21],其中一些基因可能同时参与多个环境胁迫的响应。
  2.6 PHD家族基因在盐胁迫下的表达分析
  本研究以0.8% NaCl的处理高耐盐品种‘高粱蔗’(GZ)与盐敏感材料‘河农16’(HN16)的三叶期幼苗0、48h和72h,分析两个品种PHD家族基因的表达变化。结果表明,共有65个PHD成员在盐胁迫下有表达。由图9所示,多数基因随盐胁迫时间增长表达量无明显变化;SORBI_3004182900在不同处理下表达最活跃。SORBI_3007G130300在‘河农16’内三个时期的表达量均显著高于‘高粱蔗’。SORBI_3001G425900在河农16盐胁迫48h后表达量显著高于CK,而在耐盐的高粱蔗内盐胁迫72h后表达量较盐胁迫48h后显著上升,说明该基因可能在响应盐胁迫过程中起到重要作用。   3 结论与讨论
  高粱因其抗性强和产量高的特点,作为耐盐模式植物,受到科学家青睐。前人研究表明,PHD基因参与高盐[11]、干旱[13]和低温等逆境胁迫,并对根系发育及木质素合成[14]等具有重要作用。
  本文利用生物信息学技术筛选出79个高粱PHD家族基因,并结合转录组数据对盐胁迫下高粱PHD家族基因表达模式进行了分析。高粱的基因组大小约为730Mb,约为谷子基因组(490Mb)的1.5倍,但高粱PHD家族基因的数量仅为谷子PHD家族基因的1.2倍,这可能是在高粱进化过程中,部分高粱PHD家族基因丢失。系统发育树显示,高粱PHD家族基因可以分为6个亚族,这与马卉[22]对水稻PHD家族基因的分组一致,相同亚族内的PHD基因亲缘关系较近,且相同分支的PHD基因可能具有相似的功能;鉴定出的79个高粱PHD家族基因中69个内含子较短,10个无内含子,可能是过强的选择压力导致部分PHD家族基因内含子丢失[23];79个高粱PHD基因中有1对基因的Ka/Ks值小于1,表明该对基因可能长期受到人类的定向选择;顺式作用元件分析显示高粱PHD基因含有生长发育、激素调节、胁迫应答和防御机制相关的多种顺式作用元件,推测这些基因可能参与高粱的胁迫应答反应。植物遇到盐胁迫时,往往通过调节光合作用、维持渗透压平衡、提高抗氧化能力和调节吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)等激素来抵御盐胁迫[24-25]。研究发现,过表达水稻PHD家族基因OsMsr16可以提高脯氨酸和可溶性糖含量,增强植株的渗透调节能力,从而增强水稻的耐盐能力[26]。水稻和高粱的亲缘关系较近,可以推测高粱中可能也存在类似功能的PHD家族基因。对高粱不同品种盐胁迫下转录组数据分析显示,79个高粱PHD基因中65个有表达,其中SORBI_3001G425900基因在‘河农16’盐胁迫下48h和高粱蔗72h下表达量显著升高;该基因的顺式作用元件含有多个抗逆胁迫响应元件,因此推测该基因可能参与高粱盐胁迫下的应答过程,受盐胁迫的诱导表达。
  本研究通过生物信息学技术从高粱中筛选出79个PHD家族基因,结合盐胁迫下的基因表达数据分析,发现SORBI_3001G425900可能参与高粱盐胁迫下的应答过程,该基因在盐胁迫下的调控模式有待进一步研究。本研究结果为研究PHD家族基因在高粱中逆境应答机制提供了参考。
  参 考 文 献:
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