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摘要 分别以菌株JW14-1和CW15为材料，分离出只具有交配型Ⅰ基因的无性单孢子和只具有交配型Ⅱ基因的无性单孢子，将这2种无性单胞菌株进行配对，通过测定虫草素含量对配对后的变异株进行选育，获得2株虫草素含量显著增加的优良变异菌株；进一步利用RT-PCR技术检测虫草素合成相关基因的表达情况。结果表明：虫草素含量高的菌株6号配对株中腺苷酸琥珀酸合成酶基因的表达水平最低，而5′-nucleotidase基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因的表达水平则最高。该研究为蛹虫草的定向选育提供了新的思路。
关键词 蛹虫草；无性单孢子；虫草素；配对选育
中图分类号 S567.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）23-0091-02
Abstract Theasexual single spore strains with mating type Ⅰ gene or mating type Ⅱ gene were isolated from strain JW14-1 and CW15，respectively，and the two mutant strains with higher cordycepin content were selected through the matching selection with these two asexual single spore strains.Further researches indicated the No.6 strain with high content of cordycepin showed the low expression level of adenylosuccinate synthetase and high transcriptional level of 5′-nucleotidase and purine nucleoside phosphorylase.This study provided a novel idea for the directional breeding of Cordyceps militaris.
Key words Cordyceps militaris；aesual single spore；cordycepin；matching selection
蛹蟲草（Cordyceps militaris），又称北虫草，属子囊菌亚门（Asicomyxotinae）麦角菌科（Clavicipitanceae）虫草属[1]。它是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等夜蛾科昆虫蛹体及幼虫上形成的虫菌复合体[2]。蛹虫草是一种具有滋补作用的中药和营养品，其主要包含虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、麦角甾醇等物质，功效与冬虫夏草相似，而且虫草素含量和抗氧化活性高于多重夏草，是冬虫夏草良好的代用品[3-4]。虫草素作为蛹虫草重要的生物活性成分之一，自从20世纪中期被发现并分离得到纯品开始，人们就不断研究虫草素的生物活性作用，包括抗肿瘤、免疫调节、抑制抗炎、与环磷酰胺有明显的协同作用，并有降血糖的作用[5]。
自然界原始分离得到的蛹虫草菌株中虫草素含量一般较低，因此选育虫草素含量高、生长迅速的蛹虫草新菌种有着十分重要的意义。现阶段一般主要采用化学诱变、辐射诱变、航天诱变、有性单孢杂交等方法选育蛹虫草新菌种，笔者采用无性单孢子配对的方法选育蛹虫草新菌种，为蛹虫草的定性选育提供新的思路与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所用的菌株JW14-1采购于中国典型培养物保藏中心，菌株CW15采自于长白山。尖草型菌株JW14-1分离出的单分生孢子挑选出只具有交配型I基因的单孢菌株，野生菌株CW15分离出的单分生孢子挑选出只具有交配型II基因的单孢菌株。
1.2 试验方法
1.2.1 蛹虫草无性单孢子分离株的获得与配对。将供试菌种接种于PDA平板上，25 ℃避光培养7 d后进行转色，在超净工作台中，取1 mL无菌水洗脱菌丝体，经过4层无菌纱布后过滤收集孢子悬液。在显微镜下观察收集的孢子悬液，根据观察结果对孢子悬液进行适当稀释。取0.1 mL稀释后的孢子悬液在含有PDA培养基的培养皿中进行均匀涂布，然后将涂布培养的培养皿于20 ℃避光倒置培养7 d待有肉眼可见的菌落出现后，挑取单菌落，将单菌落中的菌丝体接入新的PDA平板上25 ℃避光培养，菌丝体长满平板后，刮取菌丝。将经过检测的含有不同交配型基因的单孢菌丝放入同一瓶种子培养液中，22 ℃，避光震荡培养（125 r/min）4 d后开始出草试验工作。
1.2.2 基因组DNA的提取。采用改进的CTAB法[6]提取所收集的蛹虫草菌丝体样本基因组DNA。
1.2.3 交配型基因分子鉴定。蛹虫草的交配型位点上存在着2类相互不同源的交配型基因：一类是MAT-alpha（MAT1-1-1和MAT1-1-2），另一類是MAT-HMG（MAT1-2-1）。使用PCR方法对交配型基因类型进行分子鉴定[7]，结果如表1所示。
1.2.4 虫草素含量测定。精密称取蛹虫草粉末0.5 g，置于50 mL量瓶中，加10%甲醇水溶液至刻度线，精密称量，超声提取（55 kHz，20 ℃）10 min，冷却至室温，用10%甲醇水溶液补足失重，摇匀，离心10 min（4 000 r/min），过滤，滤液为样品提取液。虫草素含量的测定采用高效液相色谱法，检测条件为色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，进样体积10 μL，柱温25 ℃，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱程序为0 min（90%B）→5 min （78%B）→12 min（74.5%B）。 1.2.5 RNA提取。采用Trizol法[8]提取蛹虫草子实体总RNA。
1.2.6 RT-PCR检测虫草素相关基因的表达。根据反转录试剂盒操作说明书（PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）对提取的蛹虫草子实体总RNA进行反转录操作。将反转录的cDNA样本作为PCR的模板，以虫草菌株肌动蛋白基因actin作为内参基因，对5′-nucleotidase、腺苷酸琥珀酸合成酶、嘌呤核苷磷酸化酶这3个虫草素相关基因进行半定量分析。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，actin基因25个循环，其他3个基因35个循环；72 ℃后延伸10 min。基因引物序列见表2。
2 结果与分析
2.1 单交配型基因无性单孢子筛选结果
蛹虫草的无性孢子容易在PDA培养基上萌发，一般在涂布后3 d可观察到PDA平板上有孢子萌发的迹象，5 d后有肉眼可见的小菌落在平板上形成。挑取单菌落放入新的PDA平板培养萌发9 d后提取菌丝体DNA，PCR鉴定其交配型类型。菌株JW14-1和菌株CW15分离的无性单孢中，有的单孢子只含有交配型I基因，有的单孢子只含有交配型II基因，有的单孢子则2种交配型基因都含有（图1），在JW14-1单孢分离株中，1号、4号、5号3个单孢分离株只含交配型I基因，在CW15单孢分离株中，9号单孢分离株只含有交配型II基因（图1）。最终经过PCR鉴定，从29个JW14-1的单孢子中挑选出12个只含有交配型I基因的单孢分离株，从46个CW15的单孢中挑选出8个只含有交配型II基因的单孢分离株。将这12个JW14-1单孢与这8个CW15的单孢菌株进行配对培养。根据优良菌种菌丝洁白，浓密粗壮，呈匍匐装紧贴在培养基上，边缘整齐，没有明显的绒毛状白色的气生菌丝，菌丝见光后会变金黄色等特点，最终选出了16株配对菌种进行出草培养试验。
2.2 配对菌株子实体中虫草素含量的比较分析
初步选育的16株配对菌株接种培养60 d后，检测各菌株子实体中虫草素的含量，结果表明：亲本株CW15子实体中虫草素含量仅为0.392%，JW14-1子实体中虫草素含量为0.515%。16个配对菌种中，所有菌种子实体中虫草素含量均高于亲本株CW15，14个菌种的虫草素含量与亲本株 JW14-1相差不大，但6号和14号配对菌株子实体中虫草素含量均達到了0.763%，具有进一步开发利用的重要价值（表3）。
2.3 菌株子实体中虫草素相关基因的表达分析
Zheng P等[8]利用NGS对蛹虫草 Cm01菌株的基因组进行Denovo测序，获得蛹虫草的基因组序列并找到了腺嘌呤和腺苷代谢的相关基因。Yin Y等[9]对假设的虫草素合成途径上的相关基因进行研究，结果表明，不同基因在菌丝体和子实体中的表达不同。根据上述文献，可认为腺苷酸琥珀酸合成酶、5′-nucleotidase和嘌呤核苷磷酸化酶可能在虫草素合成过程中起到了较为重要的作用。为此，分别采集培养60 d后的CW15、JW14-1、5号配对株以及6号配对株的子实体，提取总RNA，利用RT-PCR技术检测3个基因在这些菌株中的表达情况，结果如图2所示。可以看出，腺苷酸琥珀酸合成酶基因在CW15中的表达水平最高，在6号配对株中的表达水平最低；5′-nucleotidase基因在JW14-1中的表达水平最低，在6号配对株中的表达水平最高；嘌呤核苷磷酸化酶基因在CW15中的表达水平最低，在6号配对株中的表达水平最高。因此，高虫草素含量菌株（6号配对株）中的5′-nucleotidase基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因具有高水平表达，而腺苷酸琥珀酸合成酶基因的表达水平则相反。
3 结论与讨论
食用菌的杂交育种中，有性杂交育种是目前食用菌种改良的一种主要手段，无性杂交育种则用的较少。在亲本性状的变异表现型中，有性单孢子的变异主要来源于核基因的重组和分离，而无性单孢子的变异则与核外的遗传物质如细胞质因子有关[10]。本文利用不同交配型基因无性单孢菌株配对的方式，获得了虫草素含量显著提升的蛹虫草菌种，认为该菌种的核外遗传物质可能发生了某种变异，这种变异可能直接或间接影响了虫草素代谢通路中某些相关基因的表达。据此，大胆推测，在食用菌中，核外遗传物质是否更多与次生代谢相关。因此，本工作可能为无性杂交技术改良菌种的次生代谢活性提供了一些新思路。
4 参考文献
[1] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：331- 333.
[2] 林晓民，李振岐，侯军.中国大型真菌多样性[M].北京：中国农业出版社，2004：38-39.
[3] 陈宏伟，陈安徽，邵颖，等.蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力的研究[J].食品与发酵工业，2009，35（6）：54-58.
[4] 胡丰林，李增智.虫草及相关真菌的次生代谢产物及其活性[J].菌物学报，2007，26（4）：607-632.
[5] 彭国平，李红阳.冬虫夏草与人工蛹虫草的成分比较[J].南京中医药大学学报，1997，12（ 5）：26- 27.
[6] 张红，秦莲花，谭琦，等.用改进的CTAB法提取香菇基因组DNA[J].上海大学学报（自然科学版），2006，12（5）：547-550.
[7] 谭琦，蔡涛，汪虹，等.蛹虫草无性孢子的交配型基因类型的分子鉴定[J].上海农业学报，2011，27（3）：5-8.
[8] ZHENG P，XIA Y，XIAO G，et al.Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris，a valued traditional chinese med-icine[J].Genome Biology，2011，12（11）：1-21.
[9] YIN Y，YU G，CHEN Y，et al.Genome-wide transcriptome and proteome analysis on different developmental stages of Cordyceps militaris[J].PLoS one，2012，7（12）：e51853.
[10] 潘迎捷，汪昭月，白韻琴，等.食用菌育种中的有性杂交与无性杂交[J].食用菌，1994（1）：2-3.
关键词 蛹虫草；无性单孢子；虫草素；配对选育
中图分类号 S567.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）23-0091-02
Abstract Theasexual single spore strains with mating type Ⅰ gene or mating type Ⅱ gene were isolated from strain JW14-1 and CW15，respectively，and the two mutant strains with higher cordycepin content were selected through the matching selection with these two asexual single spore strains.Further researches indicated the No.6 strain with high content of cordycepin showed the low expression level of adenylosuccinate synthetase and high transcriptional level of 5′-nucleotidase and purine nucleoside phosphorylase.This study provided a novel idea for the directional breeding of Cordyceps militaris.
Key words Cordyceps militaris；aesual single spore；cordycepin；matching selection
蛹蟲草（Cordyceps militaris），又称北虫草，属子囊菌亚门（Asicomyxotinae）麦角菌科（Clavicipitanceae）虫草属[1]。它是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等夜蛾科昆虫蛹体及幼虫上形成的虫菌复合体[2]。蛹虫草是一种具有滋补作用的中药和营养品，其主要包含虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、麦角甾醇等物质，功效与冬虫夏草相似，而且虫草素含量和抗氧化活性高于多重夏草，是冬虫夏草良好的代用品[3-4]。虫草素作为蛹虫草重要的生物活性成分之一，自从20世纪中期被发现并分离得到纯品开始，人们就不断研究虫草素的生物活性作用，包括抗肿瘤、免疫调节、抑制抗炎、与环磷酰胺有明显的协同作用，并有降血糖的作用[5]。
自然界原始分离得到的蛹虫草菌株中虫草素含量一般较低，因此选育虫草素含量高、生长迅速的蛹虫草新菌种有着十分重要的意义。现阶段一般主要采用化学诱变、辐射诱变、航天诱变、有性单孢杂交等方法选育蛹虫草新菌种，笔者采用无性单孢子配对的方法选育蛹虫草新菌种，为蛹虫草的定性选育提供新的思路与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本研究所用的菌株JW14-1采购于中国典型培养物保藏中心，菌株CW15采自于长白山。尖草型菌株JW14-1分离出的单分生孢子挑选出只具有交配型I基因的单孢菌株，野生菌株CW15分离出的单分生孢子挑选出只具有交配型II基因的单孢菌株。
1.2 试验方法
1.2.1 蛹虫草无性单孢子分离株的获得与配对。将供试菌种接种于PDA平板上，25 ℃避光培养7 d后进行转色，在超净工作台中，取1 mL无菌水洗脱菌丝体，经过4层无菌纱布后过滤收集孢子悬液。在显微镜下观察收集的孢子悬液，根据观察结果对孢子悬液进行适当稀释。取0.1 mL稀释后的孢子悬液在含有PDA培养基的培养皿中进行均匀涂布，然后将涂布培养的培养皿于20 ℃避光倒置培养7 d待有肉眼可见的菌落出现后，挑取单菌落，将单菌落中的菌丝体接入新的PDA平板上25 ℃避光培养，菌丝体长满平板后，刮取菌丝。将经过检测的含有不同交配型基因的单孢菌丝放入同一瓶种子培养液中，22 ℃，避光震荡培养（125 r/min）4 d后开始出草试验工作。
1.2.2 基因组DNA的提取。采用改进的CTAB法[6]提取所收集的蛹虫草菌丝体样本基因组DNA。
1.2.3 交配型基因分子鉴定。蛹虫草的交配型位点上存在着2类相互不同源的交配型基因：一类是MAT-alpha（MAT1-1-1和MAT1-1-2），另一類是MAT-HMG（MAT1-2-1）。使用PCR方法对交配型基因类型进行分子鉴定[7]，结果如表1所示。
1.2.4 虫草素含量测定。精密称取蛹虫草粉末0.5 g，置于50 mL量瓶中，加10%甲醇水溶液至刻度线，精密称量，超声提取（55 kHz，20 ℃）10 min，冷却至室温，用10%甲醇水溶液补足失重，摇匀，离心10 min（4 000 r/min），过滤，滤液为样品提取液。虫草素含量的测定采用高效液相色谱法，检测条件为色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，进样体积10 μL，柱温25 ℃，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱程序为0 min（90%B）→5 min （78%B）→12 min（74.5%B）。 1.2.5 RNA提取。采用Trizol法[8]提取蛹虫草子实体总RNA。
1.2.6 RT-PCR检测虫草素相关基因的表达。根据反转录试剂盒操作说明书（PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）对提取的蛹虫草子实体总RNA进行反转录操作。将反转录的cDNA样本作为PCR的模板，以虫草菌株肌动蛋白基因actin作为内参基因，对5′-nucleotidase、腺苷酸琥珀酸合成酶、嘌呤核苷磷酸化酶这3个虫草素相关基因进行半定量分析。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，actin基因25个循环，其他3个基因35个循环；72 ℃后延伸10 min。基因引物序列见表2。
2 结果与分析
2.1 单交配型基因无性单孢子筛选结果
蛹虫草的无性孢子容易在PDA培养基上萌发，一般在涂布后3 d可观察到PDA平板上有孢子萌发的迹象，5 d后有肉眼可见的小菌落在平板上形成。挑取单菌落放入新的PDA平板培养萌发9 d后提取菌丝体DNA，PCR鉴定其交配型类型。菌株JW14-1和菌株CW15分离的无性单孢中，有的单孢子只含有交配型I基因，有的单孢子只含有交配型II基因，有的单孢子则2种交配型基因都含有（图1），在JW14-1单孢分离株中，1号、4号、5号3个单孢分离株只含交配型I基因，在CW15单孢分离株中，9号单孢分离株只含有交配型II基因（图1）。最终经过PCR鉴定，从29个JW14-1的单孢子中挑选出12个只含有交配型I基因的单孢分离株，从46个CW15的单孢中挑选出8个只含有交配型II基因的单孢分离株。将这12个JW14-1单孢与这8个CW15的单孢菌株进行配对培养。根据优良菌种菌丝洁白，浓密粗壮，呈匍匐装紧贴在培养基上，边缘整齐，没有明显的绒毛状白色的气生菌丝，菌丝见光后会变金黄色等特点，最终选出了16株配对菌种进行出草培养试验。
2.2 配对菌株子实体中虫草素含量的比较分析
初步选育的16株配对菌株接种培养60 d后，检测各菌株子实体中虫草素的含量，结果表明：亲本株CW15子实体中虫草素含量仅为0.392%，JW14-1子实体中虫草素含量为0.515%。16个配对菌种中，所有菌种子实体中虫草素含量均高于亲本株CW15，14个菌种的虫草素含量与亲本株 JW14-1相差不大，但6号和14号配对菌株子实体中虫草素含量均達到了0.763%，具有进一步开发利用的重要价值（表3）。
2.3 菌株子实体中虫草素相关基因的表达分析
Zheng P等[8]利用NGS对蛹虫草 Cm01菌株的基因组进行Denovo测序，获得蛹虫草的基因组序列并找到了腺嘌呤和腺苷代谢的相关基因。Yin Y等[9]对假设的虫草素合成途径上的相关基因进行研究，结果表明，不同基因在菌丝体和子实体中的表达不同。根据上述文献，可认为腺苷酸琥珀酸合成酶、5′-nucleotidase和嘌呤核苷磷酸化酶可能在虫草素合成过程中起到了较为重要的作用。为此，分别采集培养60 d后的CW15、JW14-1、5号配对株以及6号配对株的子实体，提取总RNA，利用RT-PCR技术检测3个基因在这些菌株中的表达情况，结果如图2所示。可以看出，腺苷酸琥珀酸合成酶基因在CW15中的表达水平最高，在6号配对株中的表达水平最低；5′-nucleotidase基因在JW14-1中的表达水平最低，在6号配对株中的表达水平最高；嘌呤核苷磷酸化酶基因在CW15中的表达水平最低，在6号配对株中的表达水平最高。因此，高虫草素含量菌株（6号配对株）中的5′-nucleotidase基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因具有高水平表达，而腺苷酸琥珀酸合成酶基因的表达水平则相反。
3 结论与讨论
食用菌的杂交育种中，有性杂交育种是目前食用菌种改良的一种主要手段，无性杂交育种则用的较少。在亲本性状的变异表现型中，有性单孢子的变异主要来源于核基因的重组和分离，而无性单孢子的变异则与核外的遗传物质如细胞质因子有关[10]。本文利用不同交配型基因无性单孢菌株配对的方式，获得了虫草素含量显著提升的蛹虫草菌种，认为该菌种的核外遗传物质可能发生了某种变异，这种变异可能直接或间接影响了虫草素代谢通路中某些相关基因的表达。据此，大胆推测，在食用菌中，核外遗传物质是否更多与次生代谢相关。因此，本工作可能为无性杂交技术改良菌种的次生代谢活性提供了一些新思路。
4 参考文献
[1] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：331- 333.
[2] 林晓民，李振岐，侯军.中国大型真菌多样性[M].北京：中国农业出版社，2004：38-39.
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[4] 胡丰林，李增智.虫草及相关真菌的次生代谢产物及其活性[J].菌物学报，2007，26（4）：607-632.
[5] 彭国平，李红阳.冬虫夏草与人工蛹虫草的成分比较[J].南京中医药大学学报，1997，12（ 5）：26- 27.
[6] 张红，秦莲花，谭琦，等.用改进的CTAB法提取香菇基因组DNA[J].上海大学学报（自然科学版），2006，12（5）：547-550.
[7] 谭琦，蔡涛，汪虹，等.蛹虫草无性孢子的交配型基因类型的分子鉴定[J].上海农业学报，2011，27（3）：5-8.
[8] ZHENG P，XIA Y，XIAO G，et al.Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris，a valued traditional chinese med-icine[J].Genome Biology，2011，12（11）：1-21.
[9] YIN Y，YU G，CHEN Y，et al.Genome-wide transcriptome and proteome analysis on different developmental stages of Cordyceps militaris[J].PLoS one，2012，7（12）：e51853.
[10] 潘迎捷，汪昭月，白韻琴，等.食用菌育种中的有性杂交与无性杂交[J].食用菌，1994（1）：2-3.