论文部分内容阅读
[摘 要]耐药革兰氏细菌的传播构成了严重的临床威胁。它们感染生物体是引起生物体死亡的主要原因。传统药物的开发会导致新型耐药细菌的出现，使这种新型抗生素依然没有疗效。因此，我们致力于研发出一种和抗生素相比对细菌的治疗效果更加显著的新型药物---抗菌肽。它们的两亲性而不是它们的二级结构可以解释它们对这些耐药菌的抗菌活性。由于从疏水的中间部分分离出亲水端的肽能有效的对抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，所以沿纵向方向的两亲性肽能有效地对抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
[关键词]抗菌肽；耐药革兰氏细菌
中图分类号：R378 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）14-0362-01
引言
细菌感染是导致全球死亡的一个主要原因，不断升级的抗生素耐药性问题，导致了许多抗生素冗余，造成了发达国家、发展中国家死亡率不断提高，特别是革兰氏阴性菌发病率正以惊人的速度破坏抗菌药物的效力。克服抗药性感染最优化的策略是研发新型的具有较强抗菌作用的药物，特别是作用在细菌细胞膜的抗菌肽。
当微生物感染脊椎动物和无脊椎动物时，分泌细胞因子，趋化因子和其他肽是动物先天免疫的一个重要组成部分，在哺乳动物，两栖动物，昆虫等先天性免疫中那些其他肽中是抗菌肽起作用。事实上，在生物体如细菌，原生动物，真菌，植物和动物中已经确定了2300多种不同的抗菌肽，大多数的抗菌肽至少含有10个氨基酸残基，净电荷范围从-3到+20，疏水性<60%，这些特性奠定了抗菌肽的抗菌活性，使它们能够与革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞膜结合，并形成破坏革兰氏细菌细胞膜的孔洞，引起细菌细胞内容物泄露。因为抗菌肽具有α-螺旋结构，能够与细胞质膜的阴离子组分相互作用，因而诱导形成的孔洞是“环型”，“地毯型”“桶-桶板型”。此外，许多抗菌肽通过与细胞膜的磷脂酸壁和LPS相互作用的抗内毒素活性来预防感染性休克。和常规抗生素相比，抗菌肽更能消弱细胞膜，增强细胞膜的通透性，使胞内抗生素浓度达到杀死细菌的水平，这点是传统抗生素无法实现的。
1.耐药菌的耐药机制
现有的研究表明，一些常规耐药菌之所以耐药，是因为它们存在着非常明确的耐药机制，具体如下：
1.1耐药菌的外膜通透性较低
细菌的细胞壁具有外膜和内膜两层膜，内膜为脂质双分子层，具有流动性，外膜是有6-7个饱合脂肪酸链组成的脂多糖，流动性较低，脂溶性的药物很难通过，水溶性物质会依赖水溶性通道蛋白通过，但是像铜绿杆菌等耐药菌的外膜仍然没有高通透性的空蛋白，因而具有耐药性。
1.2耐药菌的外膜蛋白D2的丢失
D2蛋白对于亚胺培南来说，是能够高度抗菌的一种外膜特异性通道。一旦D2蛋白的基因发生突变，就会引起D2蛋白的丢失，从而会导致编码区DNA片段的丢失，细菌产生强烈的耐药性。
1.3耐药菌外膜上存在着独特的药物主动外排系统
一般来说，存在耐药菌外膜上的药物主动外排系统由将药物排除菌体外的外膜通道蛋白、能够识别药物的内膜蛋白和能够直接将药物泵出菌体外的膜融合蛋白三部分组成，直接性地决定了这种外膜泵系统对药物具有一定的排斥作用，并且细菌细胞膜上的药物外排系统通常情况下与外膜的低通透性存在协同作用，也间接性地使细菌产生了一定的耐药性。
1.4细菌可以产生内酰胺酶和氨基糖苷类钝化酶
一方面，有的细菌本身可以产生几乎所有类型的内酰胺酶，常见的内酰胺酶类有超广谱β内酰胺酶，头孢菌素酶，碳青酶烯酶等。有的细菌如铜绿假单胞菌在内酰胺类抗菌药缺乏时，会产生少量的头孢菌素酶，当抗菌药物存在时，细菌的头孢菌素酶含量会明显增加，从而分解药物，对药物产生耐药性。另一方面，细菌也可以产生氨基糖苷类修饰酶，这种酶能够使特定的氨基乙酰化、特定的羟基磷酸化或者核苷化，从而使氨基糖苷类抗菌药物钝化，还可以通過质粒传递给其他菌。
1.5靶位的改变
不同的抗菌药物在细菌表面有不同的作用靶位，当药物准确作用到细菌靶位时，可以有效地杀死细菌，举例来说，喹诺酮类抗菌药物能够抑制对能量有依赖性的DNA旋转酶和没有超螺旋酶活性的DNA拓扑异构酶来阻断DNA复制进而达到抗菌效果。PBPs是内酰胺类药物的作用靶位，这类药物可以通过抑制PBPs进而干扰细菌细胞壁的合成。像铜绿假单胞菌等细菌能够使PBPs基因变异，改变青霉素结合蛋白PBPs的结构，从而使抗菌药物与细菌无法结合或者结合率下降，对内酰胺类和喹诺酮类抗菌药物产生耐药性。
1.6细菌生物膜
目前，有科研人员提出了“渗透限制”，“营养限制”，“表型推断”三种假说，来猜测细菌生物膜的存在可能是一种细菌耐药的机制。
2.抗菌肽对细菌的作用机制
针对以上细菌耐常规抗生素的因素，我们致力于研究一种新型药物-抗菌肽，来解决细菌耐药这一顽疾。抗菌肽具有两亲性，螺旋结构，低细胞毒性，并且有较强的抗菌活性，浓度呈剂量依赖性减少细菌生物膜的形成，抗菌肽一般在较低的MIC浓度下，就能结合菌膜并导致细菌外膜去极化，因为它们有一定的净电荷数，在膜模拟环境中似乎在肽和带负电荷的细菌膜之间有足够的静电相互作用。此外，有研究表明，和其他芳香族残基相比，色氨酸残基更具有疏水性和亲和性，用色氨酸残基合理更换抗菌肽的氨基酸，能够增强抗菌肽的活性和特异性。在一般情况下，肽首先结合到细胞膜表面，由于它们的两亲性而进入膜内分裂脂质链并且形成瞬态孔，在合适的肽浓度下使膜裂解。因此，抗菌肽因为其能有效地分散细菌被膜的生物膜，有希望作为一种潜在治疗细菌引起的感染的治疗剂。
3.结论
在整个进化过程中，细菌已经设计了多种机制来保护自己避免受到损伤，因此，特异性化合物是未来抗菌药物的发现和发展达成了越来越多的共识，为此抗菌肽成为了目前研究的重点方向，因为抗菌肽能够结合LPS，诱导菌膜去极化，并且对菌膜有靶向作用，可以破坏细胞质膜的完整性，从而导致细胞内容物释放导致细胞死亡，但是用于临床应用的抗菌肽的发展的多个障碍之一是在生理盐的存在下，显着地减少了抗菌效力。有的研究表明，生理浓度的Mg2 +轻微的抑制抗菌肽对铜绿假单胞菌的抗菌活性，而其他盐没有表现出对抗菌肽抗假单胞菌活性的影响或者只是局部存在影响。Mg2+对抗菌肽抗菌活性的拮抗作用主要归因于Mg2+与抗菌肽之间对细菌细胞表面的特定结合位点存在竞争。虽然抗菌肽的临床应用还有一定的障碍，但是这个发现非常重要，仍然揭示了抗菌肽作为新型抗菌剂对细菌的潜在作用，具有广阔的发展前景。 參考文献
[1] Paterson DL. 2006. Resistance in gram-negative bacteria： Enterobacteria-ceae. Am J Infect Control 34：S20–S28.
[2] Kang CI， Kim SH， Park WB， Lee KD， Kim HB， Kim EC， Oh MD， Choe KW. 2005. Bloodstream infections caused by antibiotic-resistant gram-negative bacilli： risk factors for mortality and impact of inappropriate initial antimicrobial therapy on outcome. Antimicrob Agents Chemother 49：760–766.
[3] Pitout JD， Laupland KB. 2008. Extended-spectrum beta-lactamase- producing Enterobacteriaceae： an emerging public health concern. Lancet InfectDis8：159–166.
[4] Biswas S， Brunel JM， Dubus JC， Reynaud-Gaubert M， Rolain JM. 2012. Colistin： an update on the antibiotic of the 21st century. Expert Rev Anti Infect 10：917–934.
[5] Bertelsen K， Dorosz J， Hansen SK， Nielsen NC， Vosegaard T. 2012.Mechanisms of peptide-induced pore formation in lipid bilayers investi-gated by oriented 31 Psolid-state NMR spectroscopy.PLoSOne7：e47745.
[6] Pages JM， Sandrine AF， Mahamoud A， Bolla JM， Davin-Regli A， Che-valier J， Garnotel E. 2010. Efflux pumps of gram-negative bacteria， a new target for new molecules. Curr Top Med Chem 10：1848–1857.
[7] Zechini B， Versace I. 2009. Inhibitors of multidrug resistant efflux systems inbacteria.RecentPatAntiinfectDrugDiscov4：3750.
[8] Brogden KA. 2005. Antimicrobial peptides： pore formers or metabolic inhibitors in bacteria？ Nature Reviews Microbiology， 3（3）： 238-250.
[9] Chromek M， Slamová Z， Bergman P， Kovács L， Podracká L， Ehrén I， H？kfelt T， Gudmundsson GH， Gallo RL， Agerberth B， Brauner A. 2006. The antimicrobial peptide cathelicidin protects the urinary tract against invasive bacterial infection. Nature Medicine， 12（6）： 636-641.
[关键词]抗菌肽；耐药革兰氏细菌
中图分类号：R378 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）14-0362-01
引言
细菌感染是导致全球死亡的一个主要原因，不断升级的抗生素耐药性问题，导致了许多抗生素冗余，造成了发达国家、发展中国家死亡率不断提高，特别是革兰氏阴性菌发病率正以惊人的速度破坏抗菌药物的效力。克服抗药性感染最优化的策略是研发新型的具有较强抗菌作用的药物，特别是作用在细菌细胞膜的抗菌肽。
当微生物感染脊椎动物和无脊椎动物时，分泌细胞因子，趋化因子和其他肽是动物先天免疫的一个重要组成部分，在哺乳动物，两栖动物，昆虫等先天性免疫中那些其他肽中是抗菌肽起作用。事实上，在生物体如细菌，原生动物，真菌，植物和动物中已经确定了2300多种不同的抗菌肽，大多数的抗菌肽至少含有10个氨基酸残基，净电荷范围从-3到+20，疏水性<60%，这些特性奠定了抗菌肽的抗菌活性，使它们能够与革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的细胞膜结合，并形成破坏革兰氏细菌细胞膜的孔洞，引起细菌细胞内容物泄露。因为抗菌肽具有α-螺旋结构，能够与细胞质膜的阴离子组分相互作用，因而诱导形成的孔洞是“环型”，“地毯型”“桶-桶板型”。此外，许多抗菌肽通过与细胞膜的磷脂酸壁和LPS相互作用的抗内毒素活性来预防感染性休克。和常规抗生素相比，抗菌肽更能消弱细胞膜，增强细胞膜的通透性，使胞内抗生素浓度达到杀死细菌的水平，这点是传统抗生素无法实现的。
1.耐药菌的耐药机制
现有的研究表明，一些常规耐药菌之所以耐药，是因为它们存在着非常明确的耐药机制，具体如下：
1.1耐药菌的外膜通透性较低
细菌的细胞壁具有外膜和内膜两层膜，内膜为脂质双分子层，具有流动性，外膜是有6-7个饱合脂肪酸链组成的脂多糖，流动性较低，脂溶性的药物很难通过，水溶性物质会依赖水溶性通道蛋白通过，但是像铜绿杆菌等耐药菌的外膜仍然没有高通透性的空蛋白，因而具有耐药性。
1.2耐药菌的外膜蛋白D2的丢失
D2蛋白对于亚胺培南来说，是能够高度抗菌的一种外膜特异性通道。一旦D2蛋白的基因发生突变，就会引起D2蛋白的丢失，从而会导致编码区DNA片段的丢失，细菌产生强烈的耐药性。
1.3耐药菌外膜上存在着独特的药物主动外排系统
一般来说，存在耐药菌外膜上的药物主动外排系统由将药物排除菌体外的外膜通道蛋白、能够识别药物的内膜蛋白和能够直接将药物泵出菌体外的膜融合蛋白三部分组成，直接性地决定了这种外膜泵系统对药物具有一定的排斥作用，并且细菌细胞膜上的药物外排系统通常情况下与外膜的低通透性存在协同作用，也间接性地使细菌产生了一定的耐药性。
1.4细菌可以产生内酰胺酶和氨基糖苷类钝化酶
一方面，有的细菌本身可以产生几乎所有类型的内酰胺酶，常见的内酰胺酶类有超广谱β内酰胺酶，头孢菌素酶，碳青酶烯酶等。有的细菌如铜绿假单胞菌在内酰胺类抗菌药缺乏时，会产生少量的头孢菌素酶，当抗菌药物存在时，细菌的头孢菌素酶含量会明显增加，从而分解药物，对药物产生耐药性。另一方面，细菌也可以产生氨基糖苷类修饰酶，这种酶能够使特定的氨基乙酰化、特定的羟基磷酸化或者核苷化，从而使氨基糖苷类抗菌药物钝化，还可以通過质粒传递给其他菌。
1.5靶位的改变
不同的抗菌药物在细菌表面有不同的作用靶位，当药物准确作用到细菌靶位时，可以有效地杀死细菌，举例来说，喹诺酮类抗菌药物能够抑制对能量有依赖性的DNA旋转酶和没有超螺旋酶活性的DNA拓扑异构酶来阻断DNA复制进而达到抗菌效果。PBPs是内酰胺类药物的作用靶位，这类药物可以通过抑制PBPs进而干扰细菌细胞壁的合成。像铜绿假单胞菌等细菌能够使PBPs基因变异，改变青霉素结合蛋白PBPs的结构，从而使抗菌药物与细菌无法结合或者结合率下降，对内酰胺类和喹诺酮类抗菌药物产生耐药性。
1.6细菌生物膜
目前，有科研人员提出了“渗透限制”，“营养限制”，“表型推断”三种假说，来猜测细菌生物膜的存在可能是一种细菌耐药的机制。
2.抗菌肽对细菌的作用机制
针对以上细菌耐常规抗生素的因素，我们致力于研究一种新型药物-抗菌肽，来解决细菌耐药这一顽疾。抗菌肽具有两亲性，螺旋结构，低细胞毒性，并且有较强的抗菌活性，浓度呈剂量依赖性减少细菌生物膜的形成，抗菌肽一般在较低的MIC浓度下，就能结合菌膜并导致细菌外膜去极化，因为它们有一定的净电荷数，在膜模拟环境中似乎在肽和带负电荷的细菌膜之间有足够的静电相互作用。此外，有研究表明，和其他芳香族残基相比，色氨酸残基更具有疏水性和亲和性，用色氨酸残基合理更换抗菌肽的氨基酸，能够增强抗菌肽的活性和特异性。在一般情况下，肽首先结合到细胞膜表面，由于它们的两亲性而进入膜内分裂脂质链并且形成瞬态孔，在合适的肽浓度下使膜裂解。因此，抗菌肽因为其能有效地分散细菌被膜的生物膜，有希望作为一种潜在治疗细菌引起的感染的治疗剂。
3.结论
在整个进化过程中，细菌已经设计了多种机制来保护自己避免受到损伤，因此，特异性化合物是未来抗菌药物的发现和发展达成了越来越多的共识，为此抗菌肽成为了目前研究的重点方向，因为抗菌肽能够结合LPS，诱导菌膜去极化，并且对菌膜有靶向作用，可以破坏细胞质膜的完整性，从而导致细胞内容物释放导致细胞死亡，但是用于临床应用的抗菌肽的发展的多个障碍之一是在生理盐的存在下，显着地减少了抗菌效力。有的研究表明，生理浓度的Mg2 +轻微的抑制抗菌肽对铜绿假单胞菌的抗菌活性，而其他盐没有表现出对抗菌肽抗假单胞菌活性的影响或者只是局部存在影响。Mg2+对抗菌肽抗菌活性的拮抗作用主要归因于Mg2+与抗菌肽之间对细菌细胞表面的特定结合位点存在竞争。虽然抗菌肽的临床应用还有一定的障碍，但是这个发现非常重要，仍然揭示了抗菌肽作为新型抗菌剂对细菌的潜在作用，具有广阔的发展前景。 參考文献
[1] Paterson DL. 2006. Resistance in gram-negative bacteria： Enterobacteria-ceae. Am J Infect Control 34：S20–S28.
[2] Kang CI， Kim SH， Park WB， Lee KD， Kim HB， Kim EC， Oh MD， Choe KW. 2005. Bloodstream infections caused by antibiotic-resistant gram-negative bacilli： risk factors for mortality and impact of inappropriate initial antimicrobial therapy on outcome. Antimicrob Agents Chemother 49：760–766.
[3] Pitout JD， Laupland KB. 2008. Extended-spectrum beta-lactamase- producing Enterobacteriaceae： an emerging public health concern. Lancet InfectDis8：159–166.
[4] Biswas S， Brunel JM， Dubus JC， Reynaud-Gaubert M， Rolain JM. 2012. Colistin： an update on the antibiotic of the 21st century. Expert Rev Anti Infect 10：917–934.
[5] Bertelsen K， Dorosz J， Hansen SK， Nielsen NC， Vosegaard T. 2012.Mechanisms of peptide-induced pore formation in lipid bilayers investi-gated by oriented 31 Psolid-state NMR spectroscopy.PLoSOne7：e47745.
[6] Pages JM， Sandrine AF， Mahamoud A， Bolla JM， Davin-Regli A， Che-valier J， Garnotel E. 2010. Efflux pumps of gram-negative bacteria， a new target for new molecules. Curr Top Med Chem 10：1848–1857.
[7] Zechini B， Versace I. 2009. Inhibitors of multidrug resistant efflux systems inbacteria.RecentPatAntiinfectDrugDiscov4：3750.
[8] Brogden KA. 2005. Antimicrobial peptides： pore formers or metabolic inhibitors in bacteria？ Nature Reviews Microbiology， 3（3）： 238-250.
[9] Chromek M， Slamová Z， Bergman P， Kovács L， Podracká L， Ehrén I， H？kfelt T， Gudmundsson GH， Gallo RL， Agerberth B， Brauner A. 2006. The antimicrobial peptide cathelicidin protects the urinary tract against invasive bacterial infection. Nature Medicine， 12（6）： 636-641.