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摘 要 香草兰根（茎）腐病是香草兰上重要病害之一，目前国内外尚未有基于rDNA-ITS序列的分子鉴定和系统发育树分析的报道。本研究从海南省万宁市的兴隆、长丰和南林等地的病样中分离获得了9个菌株，经过柯赫氏法则验证、形态学鉴定和分子鉴定，病原菌被鉴定为尖孢镰刀菌，表明海南省万宁市地区的香草兰根（茎）腐病病原菌是尖孢镰刀菌（Fusarium. oxysporum）。然后，基于rDNA-ITS序列构建了系统发育树并对菌株的致病性进行了测定，结果发现9个菌株在系统发育树中被聚类为遗传距离明显的2个分枝，而且分枝Ⅱ的致病性要高于分枝Ⅰ。本研究为香草兰根（茎）腐病病原物快速鉴定提供依据，对香草兰根（茎）腐病防治决策有一定的参考意义。
关键词 香草兰根（茎）腐病 ；Fusarium oxysporum ；病原鉴定 ；进化树 ；致病性
分类号 S435.73
Abstract Vanilla fusarium rot is adevastating disease. Few molecular identification and phylogenetic analysis based on rDNA-ITS sequences of the pathogen were reported. In this study， 9 isolates were obtained from 3 towns， Xinglong， Changfeng and Nanlin， of Wanning city in Hainan province. Koch's postulatestest， identifications of morphology and rDNA-ITS sequences blast were performed， results prove that the pathogen is Fusarium oxysporum. Then the phylogenetic tree was constructed based on the sequences of rDNA-ITS and the pathogenicity of the pathogens were determined， results show that strains were clustered into 2 clades with apparently genetic distance in the phylogenetic tree， and the pathogenicity of the cladeⅡwas stronger than that of the cladeⅠ. This study is useful for us to understand of vanilla fusarium rot disease from the perspective of molecular and might be conducive to the disease control.
Keywords vanilla fusarium rot ； Fusarium oxysporum ； pathogen identification ； phylogenetic tree ； pathogenicity 香草兰[Vanilla fragrans （salisb.） Amess （V.planifolia）] 是一种兰科香料作物，素有“食品香料之王”的称誉，广泛应用于食品和化妆品行业[1]。香草兰于20世纪60年代被引入我国海南和云南（西双版纳），因其经济价值高一度被大力推广种植。但是由于生产前期投入高、病害发生严重等原因，香草兰种植面积在近年来呈下降趋势[2]。香草兰根（茎）腐病是香草兰上危害最严重的病害之一。该病害全年均可发生，在多雨季节（7～10月份）发生较重，严重时可导致减产50%以上。近年来，该病害的爆发流行已经成为限制香草兰产业发展的重要瓶颈之一。
对于香草兰根（茎）腐病的病原物，国内外仅有少量报道。1927 年Tucker 首先报道了该病害，并将病原物命名为尖孢镰刀菌香草兰致病变种（FusariumbatatatisWr. Var. Vanillae Tucker）[3]。1963年Gordon将其重命名为尖孢镰刀菌香草兰专化型F. oxysporum Schl. sp. Vanillae（Tuck） Gordon[4]。在1969年Alcornero和Santi认为香草兰根（茎）腐病是由尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌（F. solani）混合侵染而引起的[5]。2010年Pinaria等人从印度香草兰产区分离了542株镰刀菌，涵盖镰刀菌属的12个种，发现仅尖孢镰刀菌对香草兰具有致病性[6]。在国内，1986年，黄伙平对福建香草兰根腐病病原进行了鉴定，认为病原物是尖孢镰刀菌香草兰专化型[7]。1998年，阮兴业等人对云南省西双版纳和海南省的香草兰病害进行了综合报道，认为两地的香草兰根（茎）腐病属2种镰刀菌（尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌）混合侵染导致，其中尖孢镰刀菌香草兰专化型是主要病原菌[8]。2011年，刘爱勤等人对海南的香草兰病害进行调查，发现香草兰根（茎）腐病危害重大，其病原物鉴定结果与阮兴业等人相同[9]。但是，在以上报道中，病原物鉴定仅采用传统鉴定方法，没有涉及利用核糖体基因转录间隔序列（Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，rDNA-ITS）对香草兰根（茎）腐病菌进行辅助鉴定。在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）网站的GenBank中能够搜索到一些香草兰根（茎）腐病菌rDNA-ITS序列，其来源菌株均被鉴定为尖孢镰刀菌或者尖孢镰刀菌香草兰转化型，但没有找到相关的文章报道。 为了进一步了解香草兰根（茎）腐病病原物，本课题组在海南省万宁市兴隆、长丰和南林三个地方采集香草兰根（茎）腐病样本，进行病原菌分离纯化、形态学鉴定、分子鉴定、系统发育树构建、致病性分析等工作。
1 材料和方法
1.1 材料
本研究微生物培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[10]；病害样本采集于海南万宁的兴隆、长丰和南林等地；所用的试剂盒包括天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA 提取扩增套装”、“DNA 纯化回收”试剂盒和宝生物工程（大连）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”；所用的仪器主要有：恒温振荡器（NBS，Inonova 44R）、光学显微镜（Olympus，BX51）、生物培养箱（Percival，E-30B）、水平电泳仪（Tanon，EPS2000）、凝胶成像仪（LongGene，LG2020D）和台式离心机（Heal Force，Neofuge 18R）。
1.2 方法
1.2.1 病害样本采集和病原菌分离、纯化
2014年3～4月，分别于海南万宁的兴隆、长丰和南林等地采集香草兰根（茎）腐病病害样本。在发病严重的园块中选择处于发病初期且病害症状典型的茎蔓，用剪刀剪下收集，每园块采集样本1～2个。然后进行病原物分离纯化。将病样冲洗干净后，在超净工作台中用30%次氯酸钠消毒5 min，70%酒精消毒30 s，无菌水清洗3次后将病健交界处切成小块放在PDA培养基[10]上。将PDA平板置于26℃恒温培养箱中培养3 d。待平板中长出菌落后，从菌落边缘挑取菌丝转接于新的PDA平板中培养，重复转接5次进行纯化。
1.2.2 形态学鉴定
将分离得到的菌株接种到PAD平板上，在26℃恒温条件下培养4 d后观察菌落形态，并用单反相机（Canon EOS550D）拍照。培养14 d后用光学显微镜（Olympus BX51）在400倍视野下观察菌丝、分生孢子和厚垣孢子形态，用Image-Pro Plus 6.1图像分析软件进行图像采集和分析。
1.2.3 柯赫氏法则验证
将分离得到的菌株接种到PDA平板上，在26℃恒温条件下培养2周后将培养基打成直径0.5 cm的菌块备用。将土壤和椰糠在121℃条件下灭菌30 min，冷却后装入花盆中备用。将健康的香草兰茎蔓（去除嫩梢）后剪成50 cm长度定植在花盆上，每盆2株。用消毒过的大头针在香草兰茎节气生根基部刺3个深约0.3 cm的伤口。将准备好的菌块放置于伤口上，用无菌水脱脂棉保湿，用无菌PDA块作为对照。在室温条件下培养3周后观察结果。从发病茎秆中再次分离病原物，将分离菌株与接种菌株进行比较。
1.2.4 基因组DNA提取和rDNA-ITS序列扩增
本研究所用引物为真菌rDNA-ITS区通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。该引物扩增区间为：部分18SrDNA、ITSⅠ区-5.8SrDNA-ITSⅡ区和部分28SrDNA。引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成。基因组DNA提取和ITS序列扩增使用天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA提取扩增套装”试剂盒进行。基因组提取方法和PCR扩增体系均参照说明书进行。PCR程序为：94℃ 45 s，（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s）×30个循环，72℃ 10 min，12℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后在紫外凝胶成像仪下观测和拍照。
1.2.5 rDNA-ITS区序列的克隆、测序和BLAST比对
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，将大小约500 bp的目标条带用天根生化科技（北京）有限公司的“DNA纯化回收试剂盒”进行纯化回收。回收产物通过宝生物工程（大连）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”进行TA克隆，然后转入Escherichia coli TOP10感受态细胞中。通过菌落PCR筛选出阳性克隆子后送到深圳华大基因科技服务有限公司测序。测序结果在NCBI网站的基本局部比对搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）进行序列比对分析，根据ITS序列的同源性对分离菌株进行鉴定。
1.2.6 致病性测定
接种菌块与香草兰苗的准备与本文1.2.3小节相同。用消毒过的手术刀片在香草兰茎上横切1个深约0.3 cm的伤口，将准备好的菌块放置于伤口上，用无菌水脱脂棉保湿，以无菌PDA块作对照，每个处理10株。在室温条件下培养3周后统计病斑长度。使用SPSS 16.0对数据进行单向比较（One-way ANOVA）分析。
1.2.7 系统发育树的构建
除了本研究获得的9个香草兰根（茎）腐病菌株外，其它12个菌株的rDNA-ITS序列均从GenBank下载获得。以2株大豆猝死病病原菌F. solani（登陆号分别为AF125027和AF124995）为外群，首先用Clustal X 2.1软件进行序列比对分析，然后使用MEGA6.06软件采用Neighbor-joining计算方法和bootstrap检验方法（1 000次重复）进行系统发育树构建。
2 结果与分析
2.1 病害样本采集和病原菌分离、纯化
共从海南万宁的兴隆、长丰和南林等地采集香草兰根（茎）腐病病害样本12个。从病害样本中分离纯化出菌株9个，菌株编号及其来源详见表l。
2.2 形态学鉴定
9个菌株在PDA平板上培养4 d后，其菌落形态十分一致：菌落正面气生菌丝呈白色棉絮状（图1A），菌落背面中心区域略带紫红色（图1B）。培养14 d后，挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜400倍视野下观察分生孢子形态，9个菌株的观察结果一致：可以观测到小型分生孢子（图1C中虚线箭头所示）、大型分生孢子（图1C中实线箭头所示）和厚垣孢子（图1D中箭头所示）。经Image-Pro Plus 6.1图像分析软件测量得出小型分生孢子大小约为（2.3～4.5）μm×（5.0～15.5）μm，大型分生孢子（3.0～5.8）μm×（4.0～15.0）μm，厚垣孢子直径约为5.5～13.0 μm。分生孢子和厚垣孢子的形态特征与刘爱勤等人[11]所述F. oxysporum的形态特征一致。因此，将这9个菌株鉴定为F. oxysporum。 2.3 柯赫氏法则验证
将从田间病害样本中分离出的菌株回接到香草兰上3周后，对照茎蔓（图2A）没有发病，接菌茎蔓出现褐色皱缩的病斑（图2B），其症状与田间的香草兰根（茎）腐病（图2C）一致。而且从发病茎蔓中能够分离出与接种菌株形态一致的菌株（图2D）。依照柯赫氏法则，认为分离得到的9株真菌是香草兰根（茎）腐病的病原菌。
2.4 rDNA-ITS序列鉴定
以9个菌株的DNA为模板，使用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，9个菌株均能够扩增出大小约500 bp的目的片段（图3）。测序结果表明，扩增片段大小均为544 bp。BLAST 比对结果表明，测序片段与GenBank中的许多尖孢镰刀菌的ITS序列大小相同、相似度≥99%。这些相似度高的菌株有：尖孢镰刀菌瓜类专化型（登录号：AY188919），尖孢镰刀菌古巴专化型（登录号：HQ694500）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（登录号：AF322075），等等。结合形态学鉴定结果认为，该9株病原菌均是尖孢镰刀菌。
2.5 致病性分析
将9个菌株接种到香草兰茎蔓伤口上3周后，接菌处理的香草兰茎蔓上有褐色皱缩病斑（图4A），该症状与田间香草兰根（茎）腐病症状一致。病斑长度测量后采用Fisher's LSD tests方法进行显著性分析（P<0.05）（图4B）发现：所有9个菌株均对香草兰有致病能力，致病性最强的是VFO02菌株（病斑平均长度为3.49 cm），致病性最弱的是VFO23菌株（病斑平均长度为2.06 cm）。
2.6 系统发育树构建
将测序获得的9个rDNA-ITS片段序列，与从Genbank中下载的12个序列进行比对分析，构建系统发育树（图5）。其中所有尖孢镰刀菌被聚类在同一分枝，与茄腐镰刀菌外群有着明显的进化距离。其中尖孢镰刀菌分枝再次分为2个分枝。分枝Ⅰ（CladeⅠ）由13个菌株组成，包括5个本研究获得的菌株（VFO01、VFO 23、VFO39、VFO64和VFO65），3个以香草兰为寄主的菌株（F. oxysporum f. sp. vanillae22ma140，哥伦比亚；F. oxysporum KKK 19，印度；F. oxysporumf. sp. VanillaeML-8-1，中国云南），以及5个其他专化型菌株（F. oxysporum f. sp. Pisi Arg3；F. oxysporum f. sp. cubense E13；F. oxysporum f. sp. vasinfectum Ag149-I；F. oxysporum f. sp. ciceris FOC153；F. oxysporum f. sp. melonis MA3）。分枝Ⅱ（CladeⅡ）由5个菌株组成，包括4个本研究获得的菌株（VFO02、VFO13、VFO51和VFO52）和1个以香草兰为寄主的尖孢镰刀菌（F. oxysporum Fo235）。比较9株病原菌的致病能力（见图4），发现分枝Ⅱ中4 个菌株的病斑长度均大于分枝Ⅰ的5 个菌株，但是2 个分枝间只有部分菌株的差异达到了显著水平。并且两个分枝间有着明显的进化距离，说明香草兰根（茎）腐病病原菌的变异度较广。
3 讨论
前人对香草兰根（茎）腐病的病原物种类存在分歧，一种观点认为病原物是尖孢镰刀菌香草兰专化型；另一种观点认为尖孢镰刀菌香草兰专化型是主要病原物，茄腐镰刀菌也是该病害的病原物。本研究对海南省万宁市地区的香草兰根（茎）腐病进行采样，分离得到了9株病原菌，综合形态学和分子方法鉴定结果认为，该9株病原菌均是尖孢镰刀菌。该结果与第一种观点一致。在本研究构建的系统发育树中，9个病原菌菌株均与茄腐镰刀菌有着相当的遗传距离，也支持这些菌株均是尖孢镰刀菌的观点。鉴于尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌均是很多种植物的病原物且往往病害症状相近，本研究不排除茄腐镰刀菌也是香草兰病原菌的可能性。无论如何，本研究对了解海南省万宁地区的香草兰根（茎）腐病病原菌，尤其是以分子的角度对尖孢镰刀菌进行辅助鉴定和系统发育树分析，有一定的参考价值。
本研究分离获得的9个香草兰根（茎）腐病病原菌株在系统发育树上被聚类为遗传差异明显的2个分枝，说明该病原菌的rDNA-ITS区序列的遗传变异度很大。在进化树中，9株香草兰根（茎）腐病病原菌被分散的分别聚类于F. oxysporum各转化型之间，且遗传距离跨度较大。其原因可能有2方面：（1）香草兰是国外引进物种，其病原物可能既存在国外群体又包含本土群体；（2）目前国内外对该病害病原物的研究极少，缺乏可参考的ITS序列。此外，F. oxysporum的rDNA-ITS区序列变异度非常大，即使在研究较为透彻的香蕉枯萎病菌上也难以通过rDNA-ITS序列对生理小种进行分类[12-13]。
通过比较病原菌接种后香草兰茎蔓上形成的病斑长度，可以看出系统发育树中分枝Ⅱ的的致病能力要强于分枝Ⅰ，这说明该病害病原菌群体中有可能存在2个致病能力不同的分枝。本研究只是小样本数量的盆栽试验，并且2个分枝间的致病性差异没有全部达到显著水平，这个观点还需要更多数据支持。
参考文献
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[9] 刘爱勤，桑利伟，谭乐和，等. 海南省香草兰主要病虫害现状调查[J]. 热带作物学报，2011，32（10）：1 957-1 962.
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[13] 王文华，曾会才. 香蕉枯萎镰刀菌的核糖体DNA-ITS区段序列分析[J]. 安徽农业科学，2007，35（27）：8 440-8 442.
关键词 香草兰根（茎）腐病 ；Fusarium oxysporum ；病原鉴定 ；进化树 ；致病性
分类号 S435.73
Abstract Vanilla fusarium rot is adevastating disease. Few molecular identification and phylogenetic analysis based on rDNA-ITS sequences of the pathogen were reported. In this study， 9 isolates were obtained from 3 towns， Xinglong， Changfeng and Nanlin， of Wanning city in Hainan province. Koch's postulatestest， identifications of morphology and rDNA-ITS sequences blast were performed， results prove that the pathogen is Fusarium oxysporum. Then the phylogenetic tree was constructed based on the sequences of rDNA-ITS and the pathogenicity of the pathogens were determined， results show that strains were clustered into 2 clades with apparently genetic distance in the phylogenetic tree， and the pathogenicity of the cladeⅡwas stronger than that of the cladeⅠ. This study is useful for us to understand of vanilla fusarium rot disease from the perspective of molecular and might be conducive to the disease control.
Keywords vanilla fusarium rot ； Fusarium oxysporum ； pathogen identification ； phylogenetic tree ； pathogenicity 香草兰[Vanilla fragrans （salisb.） Amess （V.planifolia）] 是一种兰科香料作物，素有“食品香料之王”的称誉，广泛应用于食品和化妆品行业[1]。香草兰于20世纪60年代被引入我国海南和云南（西双版纳），因其经济价值高一度被大力推广种植。但是由于生产前期投入高、病害发生严重等原因，香草兰种植面积在近年来呈下降趋势[2]。香草兰根（茎）腐病是香草兰上危害最严重的病害之一。该病害全年均可发生，在多雨季节（7～10月份）发生较重，严重时可导致减产50%以上。近年来，该病害的爆发流行已经成为限制香草兰产业发展的重要瓶颈之一。
对于香草兰根（茎）腐病的病原物，国内外仅有少量报道。1927 年Tucker 首先报道了该病害，并将病原物命名为尖孢镰刀菌香草兰致病变种（FusariumbatatatisWr. Var. Vanillae Tucker）[3]。1963年Gordon将其重命名为尖孢镰刀菌香草兰专化型F. oxysporum Schl. sp. Vanillae（Tuck） Gordon[4]。在1969年Alcornero和Santi认为香草兰根（茎）腐病是由尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌（F. solani）混合侵染而引起的[5]。2010年Pinaria等人从印度香草兰产区分离了542株镰刀菌，涵盖镰刀菌属的12个种，发现仅尖孢镰刀菌对香草兰具有致病性[6]。在国内，1986年，黄伙平对福建香草兰根腐病病原进行了鉴定，认为病原物是尖孢镰刀菌香草兰专化型[7]。1998年，阮兴业等人对云南省西双版纳和海南省的香草兰病害进行了综合报道，认为两地的香草兰根（茎）腐病属2种镰刀菌（尖孢镰刀菌香草兰专化型和茄腐皮镰刀菌）混合侵染导致，其中尖孢镰刀菌香草兰专化型是主要病原菌[8]。2011年，刘爱勤等人对海南的香草兰病害进行调查，发现香草兰根（茎）腐病危害重大，其病原物鉴定结果与阮兴业等人相同[9]。但是，在以上报道中，病原物鉴定仅采用传统鉴定方法，没有涉及利用核糖体基因转录间隔序列（Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer，rDNA-ITS）对香草兰根（茎）腐病菌进行辅助鉴定。在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）网站的GenBank中能够搜索到一些香草兰根（茎）腐病菌rDNA-ITS序列，其来源菌株均被鉴定为尖孢镰刀菌或者尖孢镰刀菌香草兰转化型，但没有找到相关的文章报道。 为了进一步了解香草兰根（茎）腐病病原物，本课题组在海南省万宁市兴隆、长丰和南林三个地方采集香草兰根（茎）腐病样本，进行病原菌分离纯化、形态学鉴定、分子鉴定、系统发育树构建、致病性分析等工作。
1 材料和方法
1.1 材料
本研究微生物培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[10]；病害样本采集于海南万宁的兴隆、长丰和南林等地；所用的试剂盒包括天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA 提取扩增套装”、“DNA 纯化回收”试剂盒和宝生物工程（大连）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”；所用的仪器主要有：恒温振荡器（NBS，Inonova 44R）、光学显微镜（Olympus，BX51）、生物培养箱（Percival，E-30B）、水平电泳仪（Tanon，EPS2000）、凝胶成像仪（LongGene，LG2020D）和台式离心机（Heal Force，Neofuge 18R）。
1.2 方法
1.2.1 病害样本采集和病原菌分离、纯化
2014年3～4月，分别于海南万宁的兴隆、长丰和南林等地采集香草兰根（茎）腐病病害样本。在发病严重的园块中选择处于发病初期且病害症状典型的茎蔓，用剪刀剪下收集，每园块采集样本1～2个。然后进行病原物分离纯化。将病样冲洗干净后，在超净工作台中用30%次氯酸钠消毒5 min，70%酒精消毒30 s，无菌水清洗3次后将病健交界处切成小块放在PDA培养基[10]上。将PDA平板置于26℃恒温培养箱中培养3 d。待平板中长出菌落后，从菌落边缘挑取菌丝转接于新的PDA平板中培养，重复转接5次进行纯化。
1.2.2 形态学鉴定
将分离得到的菌株接种到PAD平板上，在26℃恒温条件下培养4 d后观察菌落形态，并用单反相机（Canon EOS550D）拍照。培养14 d后用光学显微镜（Olympus BX51）在400倍视野下观察菌丝、分生孢子和厚垣孢子形态，用Image-Pro Plus 6.1图像分析软件进行图像采集和分析。
1.2.3 柯赫氏法则验证
将分离得到的菌株接种到PDA平板上，在26℃恒温条件下培养2周后将培养基打成直径0.5 cm的菌块备用。将土壤和椰糠在121℃条件下灭菌30 min，冷却后装入花盆中备用。将健康的香草兰茎蔓（去除嫩梢）后剪成50 cm长度定植在花盆上，每盆2株。用消毒过的大头针在香草兰茎节气生根基部刺3个深约0.3 cm的伤口。将准备好的菌块放置于伤口上，用无菌水脱脂棉保湿，用无菌PDA块作为对照。在室温条件下培养3周后观察结果。从发病茎秆中再次分离病原物，将分离菌株与接种菌株进行比较。
1.2.4 基因组DNA提取和rDNA-ITS序列扩增
本研究所用引物为真菌rDNA-ITS区通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。该引物扩增区间为：部分18SrDNA、ITSⅠ区-5.8SrDNA-ITSⅡ区和部分28SrDNA。引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成。基因组DNA提取和ITS序列扩增使用天根生化科技（北京）有限公司的“快速DNA提取扩增套装”试剂盒进行。基因组提取方法和PCR扩增体系均参照说明书进行。PCR程序为：94℃ 45 s，（94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s）×30个循环，72℃ 10 min，12℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后在紫外凝胶成像仪下观测和拍照。
1.2.5 rDNA-ITS区序列的克隆、测序和BLAST比对
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，将大小约500 bp的目标条带用天根生化科技（北京）有限公司的“DNA纯化回收试剂盒”进行纯化回收。回收产物通过宝生物工程（大连）有限公司“pMD 18-T Vector Cloning Kit”进行TA克隆，然后转入Escherichia coli TOP10感受态细胞中。通过菌落PCR筛选出阳性克隆子后送到深圳华大基因科技服务有限公司测序。测序结果在NCBI网站的基本局部比对搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）进行序列比对分析，根据ITS序列的同源性对分离菌株进行鉴定。
1.2.6 致病性测定
接种菌块与香草兰苗的准备与本文1.2.3小节相同。用消毒过的手术刀片在香草兰茎上横切1个深约0.3 cm的伤口，将准备好的菌块放置于伤口上，用无菌水脱脂棉保湿，以无菌PDA块作对照，每个处理10株。在室温条件下培养3周后统计病斑长度。使用SPSS 16.0对数据进行单向比较（One-way ANOVA）分析。
1.2.7 系统发育树的构建
除了本研究获得的9个香草兰根（茎）腐病菌株外，其它12个菌株的rDNA-ITS序列均从GenBank下载获得。以2株大豆猝死病病原菌F. solani（登陆号分别为AF125027和AF124995）为外群，首先用Clustal X 2.1软件进行序列比对分析，然后使用MEGA6.06软件采用Neighbor-joining计算方法和bootstrap检验方法（1 000次重复）进行系统发育树构建。
2 结果与分析
2.1 病害样本采集和病原菌分离、纯化
共从海南万宁的兴隆、长丰和南林等地采集香草兰根（茎）腐病病害样本12个。从病害样本中分离纯化出菌株9个，菌株编号及其来源详见表l。
2.2 形态学鉴定
9个菌株在PDA平板上培养4 d后，其菌落形态十分一致：菌落正面气生菌丝呈白色棉絮状（图1A），菌落背面中心区域略带紫红色（图1B）。培养14 d后，挑取少量菌丝于载玻片上，在显微镜400倍视野下观察分生孢子形态，9个菌株的观察结果一致：可以观测到小型分生孢子（图1C中虚线箭头所示）、大型分生孢子（图1C中实线箭头所示）和厚垣孢子（图1D中箭头所示）。经Image-Pro Plus 6.1图像分析软件测量得出小型分生孢子大小约为（2.3～4.5）μm×（5.0～15.5）μm，大型分生孢子（3.0～5.8）μm×（4.0～15.0）μm，厚垣孢子直径约为5.5～13.0 μm。分生孢子和厚垣孢子的形态特征与刘爱勤等人[11]所述F. oxysporum的形态特征一致。因此，将这9个菌株鉴定为F. oxysporum。 2.3 柯赫氏法则验证
将从田间病害样本中分离出的菌株回接到香草兰上3周后，对照茎蔓（图2A）没有发病，接菌茎蔓出现褐色皱缩的病斑（图2B），其症状与田间的香草兰根（茎）腐病（图2C）一致。而且从发病茎蔓中能够分离出与接种菌株形态一致的菌株（图2D）。依照柯赫氏法则，认为分离得到的9株真菌是香草兰根（茎）腐病的病原菌。
2.4 rDNA-ITS序列鉴定
以9个菌株的DNA为模板，使用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，9个菌株均能够扩增出大小约500 bp的目的片段（图3）。测序结果表明，扩增片段大小均为544 bp。BLAST 比对结果表明，测序片段与GenBank中的许多尖孢镰刀菌的ITS序列大小相同、相似度≥99%。这些相似度高的菌株有：尖孢镰刀菌瓜类专化型（登录号：AY188919），尖孢镰刀菌古巴专化型（登录号：HQ694500）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（登录号：AF322075），等等。结合形态学鉴定结果认为，该9株病原菌均是尖孢镰刀菌。
2.5 致病性分析
将9个菌株接种到香草兰茎蔓伤口上3周后，接菌处理的香草兰茎蔓上有褐色皱缩病斑（图4A），该症状与田间香草兰根（茎）腐病症状一致。病斑长度测量后采用Fisher's LSD tests方法进行显著性分析（P<0.05）（图4B）发现：所有9个菌株均对香草兰有致病能力，致病性最强的是VFO02菌株（病斑平均长度为3.49 cm），致病性最弱的是VFO23菌株（病斑平均长度为2.06 cm）。
2.6 系统发育树构建
将测序获得的9个rDNA-ITS片段序列，与从Genbank中下载的12个序列进行比对分析，构建系统发育树（图5）。其中所有尖孢镰刀菌被聚类在同一分枝，与茄腐镰刀菌外群有着明显的进化距离。其中尖孢镰刀菌分枝再次分为2个分枝。分枝Ⅰ（CladeⅠ）由13个菌株组成，包括5个本研究获得的菌株（VFO01、VFO 23、VFO39、VFO64和VFO65），3个以香草兰为寄主的菌株（F. oxysporum f. sp. vanillae22ma140，哥伦比亚；F. oxysporum KKK 19，印度；F. oxysporumf. sp. VanillaeML-8-1，中国云南），以及5个其他专化型菌株（F. oxysporum f. sp. Pisi Arg3；F. oxysporum f. sp. cubense E13；F. oxysporum f. sp. vasinfectum Ag149-I；F. oxysporum f. sp. ciceris FOC153；F. oxysporum f. sp. melonis MA3）。分枝Ⅱ（CladeⅡ）由5个菌株组成，包括4个本研究获得的菌株（VFO02、VFO13、VFO51和VFO52）和1个以香草兰为寄主的尖孢镰刀菌（F. oxysporum Fo235）。比较9株病原菌的致病能力（见图4），发现分枝Ⅱ中4 个菌株的病斑长度均大于分枝Ⅰ的5 个菌株，但是2 个分枝间只有部分菌株的差异达到了显著水平。并且两个分枝间有着明显的进化距离，说明香草兰根（茎）腐病病原菌的变异度较广。
3 讨论
前人对香草兰根（茎）腐病的病原物种类存在分歧，一种观点认为病原物是尖孢镰刀菌香草兰专化型；另一种观点认为尖孢镰刀菌香草兰专化型是主要病原物，茄腐镰刀菌也是该病害的病原物。本研究对海南省万宁市地区的香草兰根（茎）腐病进行采样，分离得到了9株病原菌，综合形态学和分子方法鉴定结果认为，该9株病原菌均是尖孢镰刀菌。该结果与第一种观点一致。在本研究构建的系统发育树中，9个病原菌菌株均与茄腐镰刀菌有着相当的遗传距离，也支持这些菌株均是尖孢镰刀菌的观点。鉴于尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌均是很多种植物的病原物且往往病害症状相近，本研究不排除茄腐镰刀菌也是香草兰病原菌的可能性。无论如何，本研究对了解海南省万宁地区的香草兰根（茎）腐病病原菌，尤其是以分子的角度对尖孢镰刀菌进行辅助鉴定和系统发育树分析，有一定的参考价值。
本研究分离获得的9个香草兰根（茎）腐病病原菌株在系统发育树上被聚类为遗传差异明显的2个分枝，说明该病原菌的rDNA-ITS区序列的遗传变异度很大。在进化树中，9株香草兰根（茎）腐病病原菌被分散的分别聚类于F. oxysporum各转化型之间，且遗传距离跨度较大。其原因可能有2方面：（1）香草兰是国外引进物种，其病原物可能既存在国外群体又包含本土群体；（2）目前国内外对该病害病原物的研究极少，缺乏可参考的ITS序列。此外，F. oxysporum的rDNA-ITS区序列变异度非常大，即使在研究较为透彻的香蕉枯萎病菌上也难以通过rDNA-ITS序列对生理小种进行分类[12-13]。
通过比较病原菌接种后香草兰茎蔓上形成的病斑长度，可以看出系统发育树中分枝Ⅱ的的致病能力要强于分枝Ⅰ，这说明该病害病原菌群体中有可能存在2个致病能力不同的分枝。本研究只是小样本数量的盆栽试验，并且2个分枝间的致病性差异没有全部达到显著水平，这个观点还需要更多数据支持。
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