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【摘要】 目的 应用机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（continuous live cell imaging and analysis platform，cell-IQ）与流式细胞仪观察榄香烯对体外人胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响。方法：不同浓度的榄香烯作用于人胃癌SGC-7901细胞，应用机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（cell-IQ）筛选其对抑制的最佳浓度，并根据最佳作用浓度，采用流式细胞仪观察分析榄香烯对其凋亡的影响。结果：榄香烯作用于人胃癌SGC-7901细胞后，其作用随浓度增加，逐渐增强，以100μg/ml为最佳，榄香烯再增高，其抑制肿瘤作用不再增强，结果与既往采用MTT等传统方法相一致，应用流式细胞仪检测，作用24小时后榄香烯对胃癌SGC-7901细胞后主要引起细胞早期凋亡为主，为47.46±4.11%，与对照组有0.047±0.02%有明显差异。结论：1 机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（cell-IQ）能够进行细胞毒性、活性和增殖的检测和筛选;2 榄香烯对于人胃癌SGC-7901细胞有明确抑制作用，最佳浓度为100μg/ml；3 榄香烯对人胃癌SGC-7901细胞抑制作用的主要机制可能为诱导凋亡，而非细胞毒作用。
【关键词】 榄香烯；胃癌细胞；全自动活细胞观测分析系统；凋亡
榄香烯(elemene)是我国医药工作者自行开发的国家二类抗肿瘤新药，从中药温莪术中提取的油状单体，非细胞毒性抗肿瘤药。榄香烯对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用，已广泛应用于多种肿瘤的临床治疗[1]。既往细胞学研究显示榄香烯对于体外肿瘤细胞具有诱导凋亡，逆转肿瘤多药耐药，直接杀伤瘤细胞，增强免疫，抗血管生成等多种作用[2]，但是在进行相应研究时都需要对细胞造成一定程度的伤害，如免疫荧光，放射性标记，磷酸化抗体等，无法在活细胞生理条件下实时观察药物对细胞的相互作用。有鉴于此，中山医院实验中心引进了利用相差成像和机器视觉技术，能够自动鉴定分析定量细胞的形态特征的仪器，全名为全自动活细胞观测影像分析系统，在不影响细胞生长的同时，进行连续的活细胞成像和分析，观察和记录活细胞的各种运动趋势及形态特征，从而使细胞受到的外部影响降到最低。我们选用不同浓度的榄香烯作用于人胃癌SGC-7901细胞，应用机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（cell-IQ）筛选对其抑制的最佳浓度，并根据最佳作用浓度，采用流式细胞仪分析榄香烯对其凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料：榄香烯乳剂来自大连金港制药公司，5mg/ml；人SGC-7901肿瘤细胞购自中国科学院上海细胞所；小牛血清，DMEM培养基购自上海博生生物科技公司，全自动活细胞观测影像分析系统（cell-IQ）由芬兰/Chip-Man公司生产，中山医院实验中心引进，Annexin V和PI由购自上海贝博生物科技公司；
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：将人胃癌SGC-7901细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(青霉素50Iμ／ml，链霉素50mg／m1)，置37℃、5％C02培养箱中培养至对数生长期；
1.2.2 cell-IQ基本细胞参数检测：
1.2.2.1 使用48孔板，每孔接种5×10 4个细胞，加0.5ml培养基10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基置37℃、5％C02培养箱中培养至对数生长期；
1.2.2.2 待细胞贴壁后4小时后，按照实验设计分别加入25、50、100、150、200μg／ml浓度的榄香烯，以Oμg／ml为对照组；
1.2.2.3 将培养盖换成Cell IQ专用培养盖（带进气孔和空气过滤器）；
1.2.2.4 使用消毒后的胶布密封培养板和培养盖；
1.2.2.5 放入Cell IQ专用培养箱；
1.2.2.6 使用Cell IQ Imaging软件，进行调焦记录，观察48小时；
1.2.2.7 待記录结束后，使用Cell-IQ Analyser软件分析细胞的增长抑制曲线；
1.3 分组：整个实验过程分批进行，每批细胞按所要检测的指标随机分为药物处理组和空白对照组。其中药物处理组设6个浓度分别为0、25、50、100、150、200μg／ml，0μg/ml为空白对照，即不加入药物，每孔设两个复孔，作用时间为48小时。
1.4 Annexin V /PI双染检测胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响：取对数生长期的胃癌细胞1×106 /ml浓度接种于6孔培养板中，培养24h，根据cell-IQ结果100μg/ml浓度的榄香烯检测24小时；
1.4.1 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为5×106/mL,400r/min离心5min，弃去培养液；
1.4.2 用孵育缓冲液洗涤1次，400r/min离心5min；
1.4.3 用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15min；
1.4.4 400r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次；
1.4.5 加入5μl荧光标记的碘化丙啶溶液4℃下孵育20min，避光并温和振动；
1.5流式细胞仪检测
1.5.1 流式细胞仪数据分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI；
1.5.2 结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即凋亡晚期细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡早期细胞，显现（FITC+/PI-）。
1.6 统计学分析数据使用SPSS17.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（cell-IQ）分析结果：从cell-IQ获得的图像及分析(图1，2)的结果可以看到，榄香烯加入后大约3小时后人胃癌SGC-7901死亡细胞逐渐上升，超过正常细胞，cell-软件分析3-24小时作用达到最大，其中大约15-18小时为作用最强，后逐渐下降，复孔分析以及直观的细胞图片观察重复了上述结论。从图4-6可以知道随着浓度的上升，细胞死亡率逐渐升高，浓度为100μg/ml时达到最高，浓度再升高，细胞死亡率不再升高，综合数据分析100?g/ml榄香烯作用于SGC-7901细胞后12-24小时作用最强，细胞死亡率为61.00±7.90%。
图1 100μg/ml榄香烯加入后时间/细胞数曲线
图2 A对照组 0μg/ml；
B-F为25、50、100、150、200μg／ml
图3 100μg/ml榄香烯不同时间作用SGC-7901细胞后
图4不同浓度榄香烯作用SGC-7901细胞24小时时的细胞死亡率 *与对照组相比P＜0.05
图5 不同浓度榄香烯作用SGC-7901细胞后48小时时的细胞死亡率*与对照组相比P＜0.05
图6 100μg/ml榄香烯作用SGC-7901细胞后不同时间细胞死亡率
2.2 流式细胞仪分析结果 我们选择流式细胞仪观察100μg/ml榄香烯对胃癌SGC-7901细胞作用24小时凋亡的作用。在流式细胞术双参数散点图上右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为早期凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-。从FITC和PI荧光双参数点图观察到，结果发现榄香烯作用于人胃癌细胞SGC-7901后细胞凋亡率均明显高于对照组，细胞凋亡率为47.46±4.11%％，与对照组有0.047±0.02%有明显差异性。从细胞凋亡时期来看，药物作用24小时后细胞凋亡以早期凋亡为主。
图8 Annexin V /PI双染检测100μg/ml榄香烯对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响
A为100μg/ml榄香烯组 B为对照组
3讨论
机器视觉的使用使实验能够获取更多最大的时间以及空间分辨率优势，并且能够降低分析成本[3]。活细胞成像是近年来一种应用最先进的显微镜和计算机视觉系统分析活细胞动态过程的的非侵入性技术，能够分析活细胞的生长、增殖、分化、代谢、凋亡，以及其他各种生物学行为变化的新的观察研究手段[4,5]。机器视觉-全自动活细胞成像的联合使用使在不影响细胞生长的同时，观察和记录活细胞的各种运动趋势及形态特征，同时分析多孔、多位点、多种类细胞的各项指标成为可能[6,7]。
传统检测多以直接观察和手工记录为主，客观性较差，耗时费力，指标较少。MTT法具有简便、经济、安全等特点，而被广泛使用于药物对细胞的毒性、活性和细胞增殖的检测。但因其操作繁琐，需加入DMSO溶解甲瓚颗粒，且往往因溶解不全而对实验结果造成影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害，直接导致MTT法的检测稳定性不佳，对于重复性实验，结果容易出现较大差异。其他的传统生理或生化方法例如免疫荧光，放射性标记，磷酸化抗体，亲和色谱法等都需要破碎细胞或对细胞造成一定程度的伤害，无法在活细胞生理条件下实时观察药物对细胞的相互作用。
本实验研究首次应用Chipman公司生产的在细胞培养的同时，利用活细胞成像和机器视觉技术，自动鉴定分析定量细胞的形态特征的仪器cell-IQ。我们应用cell-IQ对榄香烯作用于胃癌SGC-7901细胞后的作用发现：与既往的分析方法只有少数几个时间点的实验过程的资料不同，cell-IQ系统能够连续跟踪和分析，具有强大的持续记录和分析功能。
检测细胞凋亡检测细胞凋亡有多种方法．各有其特点。流式细胞术检测细胞凋亡，具有快速、灵敏度高、可以定量等优点。Annexin V是一種Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂的特性，对磷脂酰丝氨酸(PS)有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如（PI）有拒抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。
既往研究显示诱导肿瘤细胞凋亡是榄香烯抗瘤作用机制的主要方面之一，这也是其不同于其他中药抗肿瘤药物的重要原因。从本实验结果来看，也确实证实了这一点。另外我们发现榄香烯作用于胃癌细胞后最佳作用浓度是100μg/ml,最佳作用时间为12-24小时，超过此时间，作用可能从诱导细胞凋亡转化为直接细胞毒作用，因此探索药物诱导细胞凋亡的最佳作用浓度和最佳作用时间，可为临床用药时如何发挥药物的最佳效应降低化疗药物的毒副作用提供实验基础。
参考文献
[1]时继慧.温莪术挥发油的实验药理研究— 榄香烯抗肿瘤作用的研究 ［J］中药通报，1981,6(6):32
[2]Tannock IF，Lee CM，Tunggal JK,et al.Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue:a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.Clin cancer Res.2002;878-884.
[3] Dufour P, Dufour S, Castonguay A, McCarthy N, De Koninck Y.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy for functional cellular imaging: advantages and challenges or one photon is good... but two is better! Med Sci (Paris) 2006; 22: 837-44.
[4] Shaw SL. Imaging the live plant cell. Plant J 2006; 45: 573-98.
[5] Hong Chen，Chunxue Bai and Xiangdong Wang. Application of Probes in Live Cell Imaging.Journal of Epithelial Biology & Pharmacology, 2010, 3, 40-48.
[6]Tokko H. Live cell imaging: approaches for st?dying protein dynamics in living cells. Cell Struct Funct 2002; 27: 333-4.
[7] Myers KR, Lo KW, Lye RJ, et al. Intermediate chain subunit as a
probe for cytoplasmic dynein function: biochemical analyses and live cell imaging in PC12 cells. J Neurosci Res 2007; 85: 2640-7.
【关键词】 榄香烯；胃癌细胞；全自动活细胞观测分析系统；凋亡
榄香烯(elemene)是我国医药工作者自行开发的国家二类抗肿瘤新药，从中药温莪术中提取的油状单体，非细胞毒性抗肿瘤药。榄香烯对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用，已广泛应用于多种肿瘤的临床治疗[1]。既往细胞学研究显示榄香烯对于体外肿瘤细胞具有诱导凋亡，逆转肿瘤多药耐药，直接杀伤瘤细胞，增强免疫，抗血管生成等多种作用[2]，但是在进行相应研究时都需要对细胞造成一定程度的伤害，如免疫荧光，放射性标记，磷酸化抗体等，无法在活细胞生理条件下实时观察药物对细胞的相互作用。有鉴于此，中山医院实验中心引进了利用相差成像和机器视觉技术，能够自动鉴定分析定量细胞的形态特征的仪器，全名为全自动活细胞观测影像分析系统，在不影响细胞生长的同时，进行连续的活细胞成像和分析，观察和记录活细胞的各种运动趋势及形态特征，从而使细胞受到的外部影响降到最低。我们选用不同浓度的榄香烯作用于人胃癌SGC-7901细胞，应用机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（cell-IQ）筛选对其抑制的最佳浓度，并根据最佳作用浓度，采用流式细胞仪分析榄香烯对其凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料：榄香烯乳剂来自大连金港制药公司，5mg/ml；人SGC-7901肿瘤细胞购自中国科学院上海细胞所；小牛血清，DMEM培养基购自上海博生生物科技公司，全自动活细胞观测影像分析系统（cell-IQ）由芬兰/Chip-Man公司生产，中山医院实验中心引进，Annexin V和PI由购自上海贝博生物科技公司；
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：将人胃癌SGC-7901细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(青霉素50Iμ／ml，链霉素50mg／m1)，置37℃、5％C02培养箱中培养至对数生长期；
1.2.2 cell-IQ基本细胞参数检测：
1.2.2.1 使用48孔板，每孔接种5×10 4个细胞，加0.5ml培养基10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基置37℃、5％C02培养箱中培养至对数生长期；
1.2.2.2 待细胞贴壁后4小时后，按照实验设计分别加入25、50、100、150、200μg／ml浓度的榄香烯，以Oμg／ml为对照组；
1.2.2.3 将培养盖换成Cell IQ专用培养盖（带进气孔和空气过滤器）；
1.2.2.4 使用消毒后的胶布密封培养板和培养盖；
1.2.2.5 放入Cell IQ专用培养箱；
1.2.2.6 使用Cell IQ Imaging软件，进行调焦记录，观察48小时；
1.2.2.7 待記录结束后，使用Cell-IQ Analyser软件分析细胞的增长抑制曲线；
1.3 分组：整个实验过程分批进行，每批细胞按所要检测的指标随机分为药物处理组和空白对照组。其中药物处理组设6个浓度分别为0、25、50、100、150、200μg／ml，0μg/ml为空白对照，即不加入药物，每孔设两个复孔，作用时间为48小时。
1.4 Annexin V /PI双染检测胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响：取对数生长期的胃癌细胞1×106 /ml浓度接种于6孔培养板中，培养24h，根据cell-IQ结果100μg/ml浓度的榄香烯检测24小时；
1.4.1 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为5×106/mL,400r/min离心5min，弃去培养液；
1.4.2 用孵育缓冲液洗涤1次，400r/min离心5min；
1.4.3 用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15min；
1.4.4 400r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次；
1.4.5 加入5μl荧光标记的碘化丙啶溶液4℃下孵育20min，避光并温和振动；
1.5流式细胞仪检测
1.5.1 流式细胞仪数据分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI；
1.5.2 结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即凋亡晚期细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡早期细胞，显现（FITC+/PI-）。
1.6 统计学分析数据使用SPSS17.0统计软件，多组数据间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 机器视觉-全自动活细胞观测分析系统（cell-IQ）分析结果：从cell-IQ获得的图像及分析(图1，2)的结果可以看到，榄香烯加入后大约3小时后人胃癌SGC-7901死亡细胞逐渐上升，超过正常细胞，cell-软件分析3-24小时作用达到最大，其中大约15-18小时为作用最强，后逐渐下降，复孔分析以及直观的细胞图片观察重复了上述结论。从图4-6可以知道随着浓度的上升，细胞死亡率逐渐升高，浓度为100μg/ml时达到最高，浓度再升高，细胞死亡率不再升高，综合数据分析100?g/ml榄香烯作用于SGC-7901细胞后12-24小时作用最强，细胞死亡率为61.00±7.90%。
图1 100μg/ml榄香烯加入后时间/细胞数曲线
图2 A对照组 0μg/ml；
B-F为25、50、100、150、200μg／ml
图3 100μg/ml榄香烯不同时间作用SGC-7901细胞后
图4不同浓度榄香烯作用SGC-7901细胞24小时时的细胞死亡率 *与对照组相比P＜0.05
图5 不同浓度榄香烯作用SGC-7901细胞后48小时时的细胞死亡率*与对照组相比P＜0.05
图6 100μg/ml榄香烯作用SGC-7901细胞后不同时间细胞死亡率
2.2 流式细胞仪分析结果 我们选择流式细胞仪观察100μg/ml榄香烯对胃癌SGC-7901细胞作用24小时凋亡的作用。在流式细胞术双参数散点图上右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为早期凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-。从FITC和PI荧光双参数点图观察到，结果发现榄香烯作用于人胃癌细胞SGC-7901后细胞凋亡率均明显高于对照组，细胞凋亡率为47.46±4.11%％，与对照组有0.047±0.02%有明显差异性。从细胞凋亡时期来看，药物作用24小时后细胞凋亡以早期凋亡为主。
图8 Annexin V /PI双染检测100μg/ml榄香烯对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响
A为100μg/ml榄香烯组 B为对照组
3讨论
机器视觉的使用使实验能够获取更多最大的时间以及空间分辨率优势，并且能够降低分析成本[3]。活细胞成像是近年来一种应用最先进的显微镜和计算机视觉系统分析活细胞动态过程的的非侵入性技术，能够分析活细胞的生长、增殖、分化、代谢、凋亡，以及其他各种生物学行为变化的新的观察研究手段[4,5]。机器视觉-全自动活细胞成像的联合使用使在不影响细胞生长的同时，观察和记录活细胞的各种运动趋势及形态特征，同时分析多孔、多位点、多种类细胞的各项指标成为可能[6,7]。
传统检测多以直接观察和手工记录为主，客观性较差，耗时费力，指标较少。MTT法具有简便、经济、安全等特点，而被广泛使用于药物对细胞的毒性、活性和细胞增殖的检测。但因其操作繁琐，需加入DMSO溶解甲瓚颗粒，且往往因溶解不全而对实验结果造成影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害，直接导致MTT法的检测稳定性不佳，对于重复性实验，结果容易出现较大差异。其他的传统生理或生化方法例如免疫荧光，放射性标记，磷酸化抗体，亲和色谱法等都需要破碎细胞或对细胞造成一定程度的伤害，无法在活细胞生理条件下实时观察药物对细胞的相互作用。
本实验研究首次应用Chipman公司生产的在细胞培养的同时，利用活细胞成像和机器视觉技术，自动鉴定分析定量细胞的形态特征的仪器cell-IQ。我们应用cell-IQ对榄香烯作用于胃癌SGC-7901细胞后的作用发现：与既往的分析方法只有少数几个时间点的实验过程的资料不同，cell-IQ系统能够连续跟踪和分析，具有强大的持续记录和分析功能。
检测细胞凋亡检测细胞凋亡有多种方法．各有其特点。流式细胞术检测细胞凋亡，具有快速、灵敏度高、可以定量等优点。Annexin V是一種Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂的特性，对磷脂酰丝氨酸(PS)有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如（PI）有拒抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。
既往研究显示诱导肿瘤细胞凋亡是榄香烯抗瘤作用机制的主要方面之一，这也是其不同于其他中药抗肿瘤药物的重要原因。从本实验结果来看，也确实证实了这一点。另外我们发现榄香烯作用于胃癌细胞后最佳作用浓度是100μg/ml,最佳作用时间为12-24小时，超过此时间，作用可能从诱导细胞凋亡转化为直接细胞毒作用，因此探索药物诱导细胞凋亡的最佳作用浓度和最佳作用时间，可为临床用药时如何发挥药物的最佳效应降低化疗药物的毒副作用提供实验基础。
参考文献
[1]时继慧.温莪术挥发油的实验药理研究— 榄香烯抗肿瘤作用的研究 ［J］中药通报，1981,6(6):32
[2]Tannock IF，Lee CM，Tunggal JK,et al.Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue:a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy.Clin cancer Res.2002;878-884.
[3] Dufour P, Dufour S, Castonguay A, McCarthy N, De Koninck Y.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy for functional cellular imaging: advantages and challenges or one photon is good... but two is better! Med Sci (Paris) 2006; 22: 837-44.
[4] Shaw SL. Imaging the live plant cell. Plant J 2006; 45: 573-98.
[5] Hong Chen，Chunxue Bai and Xiangdong Wang. Application of Probes in Live Cell Imaging.Journal of Epithelial Biology & Pharmacology, 2010, 3, 40-48.
[6]Tokko H. Live cell imaging: approaches for st?dying protein dynamics in living cells. Cell Struct Funct 2002; 27: 333-4.
[7] Myers KR, Lo KW, Lye RJ, et al. Intermediate chain subunit as a
probe for cytoplasmic dynein function: biochemical analyses and live cell imaging in PC12 cells. J Neurosci Res 2007; 85: 2640-7.