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摘要：2013年12月-2014年5月，在丰宁天河龙养殖有限公司进行了硬头鳟人工孵化和硬头鳟人工种间杂交试验。通过成熟卵和受精卵、过熟卵受精前后比较，受精卵不同时间卵径变化比较，受精率、发眼率、孵化率、出苗率的观察研究，结果表明：受精卵在不同时期卵径变化不大，在5.21～5.27 mm，只是颜色由浅变深，由橘黄色或淡黄色变成微红色；在平均温度为4.82 ℃时，从授精到发眼需51.7 d，有效积温达248.5 ℃·d；发眼后平均温度为6.11 ℃时28 d破膜，有效积温达391.8 ℃·d；发眼后63 d有效积温达599.7 ℃·d上浮；而在温度为7.5 ℃时，发眼后17 d就破膜，29 d就上浮，温度对冷水鱼胚胎发育影响明显；硬头鳟纯亲本人工孵化受精率、发眼率、孵化率和出苗率分别是90.2%、88.4%、85.1%、80.4%，比硬头鳟和金鳟杂交人工孵化分别高出23.1%、17.2%、15.7%、19.2%；初孵仔鱼，全身透明，背鳍原基出现，血液循环和心跳清晰可见，心跳次数80～81次/min。
关键词：硬头鳟；金鳟；人工繁育；人工杂交；卵径；胚胎发育；初孵仔鱼
我国目前养殖的鲑科鱼类主要有虹鳟、金鳟、彩虹鳟、山女鳟、硬头鳟、哲罗鱼、细鳞鱼、红点鲑等，其中虹鳟的饲养量最大。2012年我国淡水冷水鱼养殖产量为8.3万t，而鲑鳟鱼产量约2.7万t，占淡水冷水鱼总产量32.5%。由于近几年虹鳟的近亲繁殖，导致亲本规格越来越小，怀卵量和卵子质量越来越差，受精率低，抗病力越来越弱。为此，2013年在河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队支持下，河北省海洋与水产科学研究院和承德市水产技术推广站在丰宁天河龙养殖有限公司进行了硬头鳟人工繁育技术研究。
硬头鳟原产于美国和加拿大，我国于1998年从美国引进，目前在北京、浙江、新疆、吉林、黑龙江等地均有硬头鳟的养殖。与陆封型虹鳟相比，硬头鳟的个体较大，身体青灰发亮，背部斑点大且疏，相对怀卵量和绝对怀卵量都高于虹鳟，卵子质量也明显好于虹鳟，个体大，饱满、匀称，色泽光亮，孵化率高。目前对冷水性鱼类虹鳟、山女鳟和金鳟鱼卵、胚胎发育研究的报道相对多一些，而对有关硬头鳟的报道很少，仅限于硬头鳟苗种养殖试验[1]和硬头鳟孵化试验[2]，在国内还没有发现对硬头鳟人工繁育和胚胎发育的报道。本文将对硬头人工繁育和胚胎发育进行初步探索，旨在找到硬头鳟胚胎发育规律，为规模生产提供基础材料。
1材料与方法
1.1试验地点和材料
试验在丰宁天河龙养殖有限公司进行，所使用亲鱼为该场培育的硬头鳟亲鱼、金鳟亲鱼群体。
1.2试验时间
2013年12月-2014年5月。
1.3人工授精
1.3.1采卵人工采卵用挤腹法，即轻压成熟雌鱼后腹部，卵粒从生殖孔流出，接到用干净毛巾擦净的接卵盆内。
1.3.2采精方法同上，操作时先挤出尿、粪的等污物，再挤精液。
1.3.3人工受精将精液直接挤到挤出的鱼卵上，迅速用手轻轻地将精卵搅拌均匀，时间掌握在2～3 min内。
1.3.4脱粘将搅拌均匀的精卵立即用干净淡水冲洗，用手轻轻搅拌后，将水倒出，再加入新水，反复冲洗，直到受精卵不粘连。
1.3.5吸水脱粘后的受精卵，在水中静置30～40 min，待充分吸水膨胀后，用量筒计数转入孵化桶中进行孵化。
1.4试验方法
1.4.1成熟卵和受精卵、过熟卵受精前后比较随机取30粒成熟卵，用电子数显卡尺分别测量每粒卵的粒径并加以记录，然后用电子秤称出30粒卵的粒重，得出平均值；再随机取出同一尾亲鱼产出的卵，经受精充分吸水后，用同样方法测出卵径，称出卵粒重；同时做了2尾过熟卵受精发育，单放在2个桶内进行对比试验，其它条件相同。受精卵放入流水孵化桶中孵化，至发眼期移至平列槽孵化至出苗，孵化期间最低水温为4.5 ℃，最高为7.5 ℃。
1.4.2受精卵不同时间卵径变化比较在受精后0～4 h内，每间隔30 min采样一次，4～24 h内，每2 h采样一次，每次采样30粒；第3 d后每8 d测一次样，每次采样30粒（尾）。
1.4.3观察方法用显微镜对所有样品进行观察，当发育过程中超过50%的个体达到某个时期，则记为该发育阶段的起始时间，并用连接电脑的SZ760系列连续变倍体视显微镜影像系统和软件进行拍照记录。
1.5受精率、发眼率、孵化率、出苗率计算
受精后第8 d，从各桶随机取出受精卵50粒，挑选出混浊发白的死卵，透明的就是授精成活的卵。发眼卵以胚胎发育中出现2个眼点为标志，卵淡黄色或微红色。按常规方法计算受精率、发眼率、孵化率、出苗率。
1.6有效积温的计算
在硬头鳟胚胎发育中，完成某阶段的平均水温（℃）与发育到该阶段所需要的天数的乘积，表示有效发育积温。
1.7数据处理和分析
用QQ编辑图片制作图版，用Microsoft excel进行统计分析。
2结果
2.1成熟卵子、过熟卵子受精前后比较
2.1.1卵子授精前后变化卵子卵粒饱满，匀称，卵径比虹鳟鱼要大，色泽光亮，透明度较高，卵膜薄，稍碰即破，弹性差，颜色为橘黄色或淡黄色，大小均匀，平均为4.53 mm。受精吸水后，更加饱满有光泽，晶莹剔透，卵膜变厚有弹性，不易碎，吸水后粒径为5.17 mm，相差0.64 mm（见表1）；受精卵历经74～79 d，在不同时期卵径变化不大，在5.21～5.27 mm，只是颜色由浅变深，由橘黄色或淡黄色变成微红色（见表2）。
表1硬头鳟卵子受精前后变化
2.1.2成熟卵和过熟卵受精前后对比成熟卵呈桔黄色，半透明，卵膜内表面具分散的细小透明黄色油球，受精率高，平均达95.2%以上，发眼率达88.4%，受精前后卵径变化明显，弹性大（图1-a）；而过熟卵做的2尾，其中1尾当时受精率只有10%左右，到第二天几乎为零，另一尾当时成活率可达50%～60%，但受精卵表面不干净，发育缓慢、弹性小，到受精第16 d全部死亡，受精前卵径5.11 mm，受精后1 h卵径为5.21 mm。 2.2胚胎发育
2.2.1受精卵刚受精的受精卵色素分布均匀，含有大颗粒脂肪滴，受精吸水0.5 h后，卵径由453 mm达到5.17 mm，卵质膜和卵膜之间形成的围卵周隙扩大，卵黄膜因受刺激而迅速离开卵子的表面向外隆起形成受精膜。受精后2 h，原生质向动物极流动，逐渐形成胚盘，卵质均匀分布（图1-b）。
2.2.2囊胚期受精后第168 h，进入囊胚期，囊胚隆起达到最高，继而进入囊胚中期，细胞变小，胚盘细胞呈帽状；细胞向植物极移动，胚盘高度降低，称低囊胚，进入囊胚晚期囊胚细胞内卷下包形成胚环。如图1-c。
2.2.3原肠期受精后第546 h，进入原肠期，囊胚表面细胞向卵黄部分下包约整个胚胎的1/3，细胞集中增厚，形成胚盾；继而下包胚盘的1/2，胚盾延长；下包到胚盘的3/4，背面较为隆起。
2.2.4眼囊形成受精后第1 056 h，受精卵颜色变深，微红，分布血管，头部较明显，隐约可见吻部；出现一个眼囊， （图1-d）；脊索清晰可见，黑色素较浅， （图1-e）。
2.2.5发眼期受精后第51 d，有效积温达到250.3 ℃·d发眼（图1-f），受精卵颜色更深，深红色，头部轮廓明显，将卵黄囊全部包裹（图1-g），眼球色素出现，脑部分化明显（图1-h），脊索色素加深。而杂交鳟有效积温达到281.8 ℃·d发眼；比纯硬头鳟晚近7 d。
2.2.6出膜期受精后第79 d，有效积温达到391.8℃·d破膜而出，此时身体弧状弯曲，半透明，腹部有一个大的卵黄囊，给出膜仔鱼提供营养，卵黄囊呈椭圆形，尾鳍宽大，呈扇形，为出膜仔鱼主要运动器官（图1-i）；大部分个体背部出现黑色素，鳍褶明显，形成鳍条，出现嗅觉器官鼻子，并长出口裂图；可见尾鳍呈扇形，透明状（图1-j），出现背鳍原基，出现鳃裂，卵黄囊血管清晰，心脏位于卵黄囊前端，心跳次数80～81次/min（图1-k）；完全破膜的仔鱼体长15.92±1.34 mm，卵黄囊长8.08±1.25 mm，宽6.01±1.07 mm ，（图1-l）。
2.3仔鱼发育
受精后第114 d，孵化后卵黄囊已被吸收一半以上，开始上浮，并开口摄食人工饵料的仔鱼。纯硬头鳟，发眼后63 d，有效积温达到599.7 ℃·d上浮。
2.4受精率、发眼率、孵化率和出苗率
在相同条件下硬头鳟纯亲本人工孵化受精率、发眼率、孵化率和出苗率分别是90.2%、88.4%、85.1%、80.4%，分别比硬头鳟和金鳟杂交人工孵化高23.1%、17.2%、15.7%、19.2%。见表3。
表3硬头鳟和虹鳟杂交比较
在平均温度为4.82 ℃时，从受精到发眼需51.7 d，有效积温达248.5 ℃？d，见表4；平均温度为6.11 ℃时，发眼后29 d时破膜，有效积温达360.2 ℃·d；发眼后60 d有效积温达605.2 ℃·d上浮；而在温度为7.5 ℃时，发眼后17 d就破膜，29 d有效积温454.6 ℃·d时上浮，温度对冷水鱼胚胎发育影响明显。见表5。
表4受精卵发眼时间统计表
3.1温度对硬头鳟胚胎发育的影响
温度对胚胎发育影响较大，从受精卵到发眼，低温时胚胎发育发眼、破膜、上浮明显晚于较高温度地区，7.12 ℃时，发眼后17 d有效积温达3646 ℃·d时就破膜，29 d时有效积温达454.6 ℃·d上浮。可见在适宜的水温内，温度越高，硬头鳟受精卵孵化的时间越短，与陈术强、张玉勇等研究的温度对虹鳟、山女鳟杂交种胚胎发育的研究结果相吻合[3]。另外本试验通过使用水霉灵、甲醛等药物进行控制，孵化期间没有发现水霉病，可见在4.5～7.5 ℃时人工孵化，水霉病发生几率较低。
3.2硬头鳟成熟卵与过熟卵的比较
成熟卵子授精前后卵粒饱满有光泽，晶莹剔透，卵膜变厚有弹性，不易碎，受精率高，平均达90%以上，发眼率达88.4%，授精前后卵径变化明显，弹性大；受精卵79 d内，在不同时期卵径变化不大，在5.21～5.27 mm，与黄金善等报道的相符[4]，只是颜色由浅变深，由橘黄色或淡黄色变成微红色。而过熟卵受精率低，受精卵表面不干净，发育缓慢、弹性小，到受精第16 d全部死亡，卵径受精前后变化不大。
3.3硬头鳟卵裂期
由于硬头鳟卵壁较厚，在受精过程中未采取相关措施，在显微镜下没有观察到卵裂各细胞期，有待于今后进一步研究进行观察。
a.未受精卵 b.受精卵 c.囊胚期 d.眼囊形成期 e.脊索形成 f.发眼期
g.胚胎完全包裹卵黄囊 h.头尾相接 i.出膜前期 j.吻部明显 k.呼吸系统明显 l.完全破膜
图1硬头鳟胚胎发育照片
参考文献：
[1]
陶洋洲.硬头鳟孵化试验[J].科学养鱼，1998（7）：32
[2] 刘澧津.硬头鳟苗种养殖试验[J].河北渔业，2002（2）：48-49
[3] 陈术强，张玉勇，贾智英，等. 虹鳟（♀）×山女鳟（♂）杂交种胚胎及仔鱼发育的研究[J].上海海洋大学学报，2010，19（6）：756-762
[4] 黄金善，范兆廷，贾忠贺，等. 沉性大卵径鱼卵的观察方法与虹鳟的胚胎发育[J].经济动物学报，2005，9（4）：235-238
（收稿日期：2014-09-02；修回日期：2014-09-10）
关键词：硬头鳟；金鳟；人工繁育；人工杂交；卵径；胚胎发育；初孵仔鱼
我国目前养殖的鲑科鱼类主要有虹鳟、金鳟、彩虹鳟、山女鳟、硬头鳟、哲罗鱼、细鳞鱼、红点鲑等，其中虹鳟的饲养量最大。2012年我国淡水冷水鱼养殖产量为8.3万t，而鲑鳟鱼产量约2.7万t，占淡水冷水鱼总产量32.5%。由于近几年虹鳟的近亲繁殖，导致亲本规格越来越小，怀卵量和卵子质量越来越差，受精率低，抗病力越来越弱。为此，2013年在河北省现代农业产业技术体系淡水养殖创新团队支持下，河北省海洋与水产科学研究院和承德市水产技术推广站在丰宁天河龙养殖有限公司进行了硬头鳟人工繁育技术研究。
硬头鳟原产于美国和加拿大，我国于1998年从美国引进，目前在北京、浙江、新疆、吉林、黑龙江等地均有硬头鳟的养殖。与陆封型虹鳟相比，硬头鳟的个体较大，身体青灰发亮，背部斑点大且疏，相对怀卵量和绝对怀卵量都高于虹鳟，卵子质量也明显好于虹鳟，个体大，饱满、匀称，色泽光亮，孵化率高。目前对冷水性鱼类虹鳟、山女鳟和金鳟鱼卵、胚胎发育研究的报道相对多一些，而对有关硬头鳟的报道很少，仅限于硬头鳟苗种养殖试验[1]和硬头鳟孵化试验[2]，在国内还没有发现对硬头鳟人工繁育和胚胎发育的报道。本文将对硬头人工繁育和胚胎发育进行初步探索，旨在找到硬头鳟胚胎发育规律，为规模生产提供基础材料。
1材料与方法
1.1试验地点和材料
试验在丰宁天河龙养殖有限公司进行，所使用亲鱼为该场培育的硬头鳟亲鱼、金鳟亲鱼群体。
1.2试验时间
2013年12月-2014年5月。
1.3人工授精
1.3.1采卵人工采卵用挤腹法，即轻压成熟雌鱼后腹部，卵粒从生殖孔流出，接到用干净毛巾擦净的接卵盆内。
1.3.2采精方法同上，操作时先挤出尿、粪的等污物，再挤精液。
1.3.3人工受精将精液直接挤到挤出的鱼卵上，迅速用手轻轻地将精卵搅拌均匀，时间掌握在2～3 min内。
1.3.4脱粘将搅拌均匀的精卵立即用干净淡水冲洗，用手轻轻搅拌后，将水倒出，再加入新水，反复冲洗，直到受精卵不粘连。
1.3.5吸水脱粘后的受精卵，在水中静置30～40 min，待充分吸水膨胀后，用量筒计数转入孵化桶中进行孵化。
1.4试验方法
1.4.1成熟卵和受精卵、过熟卵受精前后比较随机取30粒成熟卵，用电子数显卡尺分别测量每粒卵的粒径并加以记录，然后用电子秤称出30粒卵的粒重，得出平均值；再随机取出同一尾亲鱼产出的卵，经受精充分吸水后，用同样方法测出卵径，称出卵粒重；同时做了2尾过熟卵受精发育，单放在2个桶内进行对比试验，其它条件相同。受精卵放入流水孵化桶中孵化，至发眼期移至平列槽孵化至出苗，孵化期间最低水温为4.5 ℃，最高为7.5 ℃。
1.4.2受精卵不同时间卵径变化比较在受精后0～4 h内，每间隔30 min采样一次，4～24 h内，每2 h采样一次，每次采样30粒；第3 d后每8 d测一次样，每次采样30粒（尾）。
1.4.3观察方法用显微镜对所有样品进行观察，当发育过程中超过50%的个体达到某个时期，则记为该发育阶段的起始时间，并用连接电脑的SZ760系列连续变倍体视显微镜影像系统和软件进行拍照记录。
1.5受精率、发眼率、孵化率、出苗率计算
受精后第8 d，从各桶随机取出受精卵50粒，挑选出混浊发白的死卵，透明的就是授精成活的卵。发眼卵以胚胎发育中出现2个眼点为标志，卵淡黄色或微红色。按常规方法计算受精率、发眼率、孵化率、出苗率。
1.6有效积温的计算
在硬头鳟胚胎发育中，完成某阶段的平均水温（℃）与发育到该阶段所需要的天数的乘积，表示有效发育积温。
1.7数据处理和分析
用QQ编辑图片制作图版，用Microsoft excel进行统计分析。
2结果
2.1成熟卵子、过熟卵子受精前后比较
2.1.1卵子授精前后变化卵子卵粒饱满，匀称，卵径比虹鳟鱼要大，色泽光亮，透明度较高，卵膜薄，稍碰即破，弹性差，颜色为橘黄色或淡黄色，大小均匀，平均为4.53 mm。受精吸水后，更加饱满有光泽，晶莹剔透，卵膜变厚有弹性，不易碎，吸水后粒径为5.17 mm，相差0.64 mm（见表1）；受精卵历经74～79 d，在不同时期卵径变化不大，在5.21～5.27 mm，只是颜色由浅变深，由橘黄色或淡黄色变成微红色（见表2）。
表1硬头鳟卵子受精前后变化
2.1.2成熟卵和过熟卵受精前后对比成熟卵呈桔黄色，半透明，卵膜内表面具分散的细小透明黄色油球，受精率高，平均达95.2%以上，发眼率达88.4%，受精前后卵径变化明显，弹性大（图1-a）；而过熟卵做的2尾，其中1尾当时受精率只有10%左右，到第二天几乎为零，另一尾当时成活率可达50%～60%，但受精卵表面不干净，发育缓慢、弹性小，到受精第16 d全部死亡，受精前卵径5.11 mm，受精后1 h卵径为5.21 mm。 2.2胚胎发育
2.2.1受精卵刚受精的受精卵色素分布均匀，含有大颗粒脂肪滴，受精吸水0.5 h后，卵径由453 mm达到5.17 mm，卵质膜和卵膜之间形成的围卵周隙扩大，卵黄膜因受刺激而迅速离开卵子的表面向外隆起形成受精膜。受精后2 h，原生质向动物极流动，逐渐形成胚盘，卵质均匀分布（图1-b）。
2.2.2囊胚期受精后第168 h，进入囊胚期，囊胚隆起达到最高，继而进入囊胚中期，细胞变小，胚盘细胞呈帽状；细胞向植物极移动，胚盘高度降低，称低囊胚，进入囊胚晚期囊胚细胞内卷下包形成胚环。如图1-c。
2.2.3原肠期受精后第546 h，进入原肠期，囊胚表面细胞向卵黄部分下包约整个胚胎的1/3，细胞集中增厚，形成胚盾；继而下包胚盘的1/2，胚盾延长；下包到胚盘的3/4，背面较为隆起。
2.2.4眼囊形成受精后第1 056 h，受精卵颜色变深，微红，分布血管，头部较明显，隐约可见吻部；出现一个眼囊， （图1-d）；脊索清晰可见，黑色素较浅， （图1-e）。
2.2.5发眼期受精后第51 d，有效积温达到250.3 ℃·d发眼（图1-f），受精卵颜色更深，深红色，头部轮廓明显，将卵黄囊全部包裹（图1-g），眼球色素出现，脑部分化明显（图1-h），脊索色素加深。而杂交鳟有效积温达到281.8 ℃·d发眼；比纯硬头鳟晚近7 d。
2.2.6出膜期受精后第79 d，有效积温达到391.8℃·d破膜而出，此时身体弧状弯曲，半透明，腹部有一个大的卵黄囊，给出膜仔鱼提供营养，卵黄囊呈椭圆形，尾鳍宽大，呈扇形，为出膜仔鱼主要运动器官（图1-i）；大部分个体背部出现黑色素，鳍褶明显，形成鳍条，出现嗅觉器官鼻子，并长出口裂图；可见尾鳍呈扇形，透明状（图1-j），出现背鳍原基，出现鳃裂，卵黄囊血管清晰，心脏位于卵黄囊前端，心跳次数80～81次/min（图1-k）；完全破膜的仔鱼体长15.92±1.34 mm，卵黄囊长8.08±1.25 mm，宽6.01±1.07 mm ，（图1-l）。
2.3仔鱼发育
受精后第114 d，孵化后卵黄囊已被吸收一半以上，开始上浮，并开口摄食人工饵料的仔鱼。纯硬头鳟，发眼后63 d，有效积温达到599.7 ℃·d上浮。
2.4受精率、发眼率、孵化率和出苗率
在相同条件下硬头鳟纯亲本人工孵化受精率、发眼率、孵化率和出苗率分别是90.2%、88.4%、85.1%、80.4%，分别比硬头鳟和金鳟杂交人工孵化高23.1%、17.2%、15.7%、19.2%。见表3。
表3硬头鳟和虹鳟杂交比较
在平均温度为4.82 ℃时，从受精到发眼需51.7 d，有效积温达248.5 ℃？d，见表4；平均温度为6.11 ℃时，发眼后29 d时破膜，有效积温达360.2 ℃·d；发眼后60 d有效积温达605.2 ℃·d上浮；而在温度为7.5 ℃时，发眼后17 d就破膜，29 d有效积温454.6 ℃·d时上浮，温度对冷水鱼胚胎发育影响明显。见表5。
表4受精卵发眼时间统计表
3.1温度对硬头鳟胚胎发育的影响
温度对胚胎发育影响较大，从受精卵到发眼，低温时胚胎发育发眼、破膜、上浮明显晚于较高温度地区，7.12 ℃时，发眼后17 d有效积温达3646 ℃·d时就破膜，29 d时有效积温达454.6 ℃·d上浮。可见在适宜的水温内，温度越高，硬头鳟受精卵孵化的时间越短，与陈术强、张玉勇等研究的温度对虹鳟、山女鳟杂交种胚胎发育的研究结果相吻合[3]。另外本试验通过使用水霉灵、甲醛等药物进行控制，孵化期间没有发现水霉病，可见在4.5～7.5 ℃时人工孵化，水霉病发生几率较低。
3.2硬头鳟成熟卵与过熟卵的比较
成熟卵子授精前后卵粒饱满有光泽，晶莹剔透，卵膜变厚有弹性，不易碎，受精率高，平均达90%以上，发眼率达88.4%，授精前后卵径变化明显，弹性大；受精卵79 d内，在不同时期卵径变化不大，在5.21～5.27 mm，与黄金善等报道的相符[4]，只是颜色由浅变深，由橘黄色或淡黄色变成微红色。而过熟卵受精率低，受精卵表面不干净，发育缓慢、弹性小，到受精第16 d全部死亡，卵径受精前后变化不大。
3.3硬头鳟卵裂期
由于硬头鳟卵壁较厚，在受精过程中未采取相关措施，在显微镜下没有观察到卵裂各细胞期，有待于今后进一步研究进行观察。
a.未受精卵 b.受精卵 c.囊胚期 d.眼囊形成期 e.脊索形成 f.发眼期
g.胚胎完全包裹卵黄囊 h.头尾相接 i.出膜前期 j.吻部明显 k.呼吸系统明显 l.完全破膜
图1硬头鳟胚胎发育照片
参考文献：
[1]
陶洋洲.硬头鳟孵化试验[J].科学养鱼，1998（7）：32
[2] 刘澧津.硬头鳟苗种养殖试验[J].河北渔业，2002（2）：48-49
[3] 陈术强，张玉勇，贾智英，等. 虹鳟（♀）×山女鳟（♂）杂交种胚胎及仔鱼发育的研究[J].上海海洋大学学报，2010，19（6）：756-762
[4] 黄金善，范兆廷，贾忠贺，等. 沉性大卵径鱼卵的观察方法与虹鳟的胚胎发育[J].经济动物学报，2005，9（4）：235-238
（收稿日期：2014-09-02；修回日期：2014-09-10）