【摘 要】
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目的 探讨曲美替尼(Trametinib)对维莫非尼(Vemurafenib)治疗BRAFV600E突变型甲状腺乳头状癌抵抗的逆转作用和机制.方法 应用CCK-8实验检测Vemurafenib及Trametinib在人甲状腺癌K-1、BCPAP细胞中的半数抑制浓度(IC50)及两药联合指数(CI).蛋白质印迹法检测Vemurafenib不同处理时间对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的抑制作用,确定产生抵抗的机制;随后联合使用Trametinib分别进行CCK-8、平板克隆、流式细胞术和蛋白质印迹实验观察
【机 构】
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川北医学院附属医院肝胆外科·肝胆胰肠研究所,四川 南充 637000
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目的 探讨曲美替尼(Trametinib)对维莫非尼(Vemurafenib)治疗BRAFV600E突变型甲状腺乳头状癌抵抗的逆转作用和机制.方法 应用CCK-8实验检测Vemurafenib及Trametinib在人甲状腺癌K-1、BCPAP细胞中的半数抑制浓度(IC50)及两药联合指数(CI).蛋白质印迹法检测Vemurafenib不同处理时间对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的抑制作用,确定产生抵抗的机制;随后联合使用Trametinib分别进行CCK-8、平板克隆、流式细胞术和蛋白质印迹实验观察肿瘤细胞的增殖、凋亡及MAPK通路变化.结果 Vemurafenib在K-1和BCPAP细胞中的IC50分别为37.21、22.61μmol/L,Trametinib的IC50分别为776.50、990.40 nmol/L;Vemurafenib处理K-1和BCPAP细胞24 h后,MAPK通路被再次激活,p-MEK、p-ERK显著升高,48 h后回升至初始水平.选用10μmol/L Vemurafenib和1μmol/L Tra-metinib进行后续实验.联合使用Trametinib可抑制Vemurafenib处理24 h后出现的p-MEK及p-ERK回升现象.Ve-murafenib及Trametinib均可有效抑制K-1(t值分别为9.113和13.150,均P<0.001)及BCPAP(t值分别为7.290和8.920,P值分别为0.002和0.009)细胞的增殖及克隆形成能力(K-1:tVemurafenib=8.898,tTrametinib=11.730,均P<0.001;BCPAP:tVemurafenib=6.015,P=0.004;tTrametinib=7.109,P=0.002),并促进细胞凋亡(K-1:tVemurafenib=3.610,P=0.023;tTrametinib=4.666,P=0.009.BCPAP:tVemurafenib=3.334,P=0.029;tTrametinib=5.603,P=0.005),差异均有统计学意义.同时,Trametinib可提高Vemurafenib抑制K-1和BCPAP细胞增殖(tK-1=10.170,tBCPAP=9.662,均P<0.001)、克隆形成(tK-1=11.660,tBCPAP=10.170,均P<0.001)及促进凋亡(tK-1=5.336,tBCPAP=5.420,均P=0.006)的能力,差异有统计学意义.在处理48 h时,与对照组相比,Vemurafenib对K-1及BCPAP细胞的增殖抑制作用(tK-1=3.893,P=0.018;tBCPAP=3.141,P=0.035)及促凋亡作用(tK-1=3.976,P=0.017;tBCPAP=4.495,P=0.011)稍降低,差异有统计学意义;对细胞克隆形成的抑制能力差异无统计学意义.Trametinib仍可有效抑制K-1及BCPAP细胞增殖(tK-1=14.190,tBCPAP=13.490,均P<0.001)及克隆形成能力(tK-1=16.470,tBCPAP=8.966,均P<0.001),并促进细胞凋亡(tK-1=6.331,P=0.003;tBCPAP=7.472,P=0.002),差异有统计学意义.同时,Trametinib仍逆转Vemurafenib处理48 h后出现的耐受现象,提高Vemurafenib抑制K-1及BCPAP细胞增殖(tK-1=23.360,tBCPAP=21.540,均P<0.001)、克隆形成(tK-1=27.320,tBCPAP=22.840,均P<0.001)及促进凋亡(tK-1=11.590,tBCPAP=13.110,均P<0.001)的能力,差异有统计学意义.结论 Vemurafenib治疗甲状腺乳头状癌所产生的耐受机制之一为MAPK通路的再度激活,联合使用MEK抑制剂Trametinib可显著提高Vemurafenib的抗肿瘤作用,逆转药物抵抗.
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