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摘 要：以“甘農三号”紫花苜蓿幼苗为材料，在水培条件下，探究了在10 d内不同浓度（0～2.0 mmol·L-1）镉（Cd）胁迫对其根长、茎长、生物量、叶绿素和丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性、Cd富集及其亚细胞分布的影响。结果表明：低浓度（0.125 mmol·L-1）Cd能促进幼苗根和茎的生长，增加叶片叶绿素含量，较高浓度（0.5～2.0 mmol·L-1）Cd显著抑制幼苗根和茎的生长，叶绿素及生物量显著降低;Cd胁迫使MDA含量显著增加，而SOD和POD活性显著增强，其中Cd胁迫浓度为0.5 mmol·L-1时，SOD和POD活性达到最大值，这可能是植物对环境胁迫的一种应激保护反应;Cd在各亚细胞组分中的含量依次为细胞壁>细胞质>线粒体>叶绿体，且均随Cd胁迫浓度的升高而增加。当Cd胁迫浓度为0.125 mmol·L-1时，水培10 d的紫花苜蓿幼苗单株地上部对Cd的净化率最高可达0.214%，而整盆植株在单位体积内对Cd的净化率最高可达15.5%;当Cd胁迫浓度为2.0 mmol·L-1时，紫花苜蓿幼苗地上部Cd含量达89.36 μg·g-1。这些结果表明紫花苜蓿对Cd具有很强的富集能力，虽未达到Cd超富集植物的临界标准，但从植株生物量、耐Cd能力、富集Cd量及对Cd的净化率等方面综合考虑，紫花苜蓿在Cd污染土壤的植物修复中具备良好的应用价值。
关键词：镉胁迫，紫花苜蓿，生理特性，镉富集，镉污染
Abstract：Taking seedlings of alfalfa variety ‘Medicago sativa cv. Gannong No. 3’，we studied the effects of Cd stress on the length of stem and root，biomass，the contents of chlorophyll and malonyldialdehyde （MDA），the activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxide enzyme （POD），Cd enrichment and Cd subcellular distribution in leaf of alfalfa seedlings under Cd stress with concentration between 0 to 20 mol·L-1 for 10 d. The results showed that length of stem and root，chlorophyll content increased under lower Cd concentration （0.125 mmol·L-1） stress. However，lower length of stem and root，biomass and chlorophyll content were observed under the higher Cd concentration （0.5～2.0 mmol·L-1） stress. Accumulation of reactive oxygen species（ROS） in alfalfa seedlings under Cd stress caused membrane lipid system peroxidation，MDA content increased significantly，while the activity of SOD and POD was significantly enhanced. When the concentration of Cd stress was 0.5 mmol·L-1，the activity of SOD and POD reached the maximum，which may be a protective reaction of plants to environmental stress，antioxidant enzyme system was started up to remove ROS accumulated during Cd stress and to mitigate membrane lipid peroxidation damage caused by Cd stress. Subcellular distribution of Cd in leaf was in the order of cell wall，cytoplasm，mitochondria，chloroplast，and the content of Cd in each subcellular fraction increased with the concentration increase of Cd stress. When the concentration of Cd was 0.125 mmol·L-1，purification rate of Cd in the shoots of individual plants grown in nutrient solution for 10 d up to 0.214%，and the purification rate of Cd for whole pot plant per unit volume up to 15.5%. When the concentration of Cd was 2.0 mmol·L-1，the content of Cd in the aboveground part of alfalfa seedlings was 89.36 μg·g-1. Those results suggest that alfalfa has a very strong enrichment ability for Cd，although it does not meet the critical criteria for Cd-rich plants. However，alfalfa has a good application value in the phytoremediation of Cd-contaminated soil，considering the plant biomass，Cd tolerance，Cd enrichment，and purification rate of Cd. Key words：Cd stress，alfalfa，physiological characteristics，Cd enrichment，Cd pollution
镉（cadmium，Cd）以硫镉矿的形式存在自然界中，近年来，随着采矿、电镀、冶金等工业活动产生的“三废”排放，导致大量Cd进入自然环境，大面积土壤被污染，形势十分严峻（Hawrylak et al.，2014;Reiser et al.，2014;陈永勤等，2015）。Cd具有毒性大、容易转移、降解困难且分解周期极长等特点，在农业生产中被农作物吸收后，除了会破坏植物的生理活动，导致其产量和质量低下外，还会被人摄取危害健康（李婧等，2015;申强等，2015）。所以，Cd污染土壤的修复已成为土壤学、生态学和环境科学等学科的研究热点和难点。
利用超富集植物吸附重金属的特性修复Cd污染土壤的方法，由于其操作简单便捷、费用少、环境友好、且可大规模实施等优点而日益受到世界研究者的重视（马彩云等，2013）。然而在自然界中具有超富集特性的植物类别很少，多数生长慢、产量低，而且只在少数地区分布。因此，从超富集植物资源中筛选生长迅速且产量高的植物成为植物修复技术的一条新思路。紫花苜蓿（Medicago sativa）是全球范围内普遍种植的草本植物，其生长快、适应能力好、根系发达、枝叶繁多、生物学产量高，在牧草业被认为是牧草之最（徐苏凌等，2008;陈银萍等，2015）。已有报道显示土壤中Cu、Zn等重金属可以被紫花苜蓿吸收富集（蘧苗苗等，2016;王文星等，2006;代惠萍等，2014;刘菊梅等，2018）。目前，关于紫花苜蓿的报道多数集中在对盐和干旱胁迫的响应（李文娆等，2010;张立全等，2012）以及重金属胁迫下种子萌发与幼苗生长及生理特性等方面（曹婷和代惠萍，2014;蘧苗苗等，2016），而紫花苜蓿对重金属Cd富集特性和Cd污染土壤修复的研究则比较缺乏。
Cd胁迫能引起植株的生理生化产生一系列的变化。长期Cd胁迫会导致细胞内活性氧（ROS）累积，进一步引起氧化胁迫，使植物根系活力下降，植物生长受抑制，叶绿素分解，植物叶片发黄干枯等（Smeets et al.，2005;王松华等，2011;尹国丽等，2013）。而抗氧化系统可以调节细胞内的ROS水平，减少对植物造成的损害（Francisco & José，2011;江玲等，2014）。本研究以紫花苜蓿幼苗为材料，分析了不同浓度Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗的生物量、光合色素、膜脂过氧化、抗氧化及Cd累积特性，探究紫花苜蓿在镉胁迫下的生长情况以及对Cd的积累，以期为阐明紫花苜蓿受镉毒害的机制与修复镉污染土壤给出指导。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
以“甘农三号”（Gannong No.3）紫花苜蓿作为实验材料，选购于甘肃农科院。Cd胁迫用5/2水合氯化镉（国药试剂），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
挑选大小均一的紫花苜蓿种子，为提高其发芽率，将种子置于温蒸馏水（50～60 ℃）中0.5 h。种子取出晾干后播种在含有1/2浓度Hoagland’s营养液的生长介质中，于室内培养架中发芽生长，共24盆，定期更换生长介质。培养30 d左右，待幼苗长出约3片叶时，挑选大小相似的21盆，分成7组，Cd胁迫试剂为CdCl2，Cd浓度梯度为0（CK）、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L-1，继续水培3 d后（水培体积为500 mL），分别对根、茎和叶进行混合取样，鲜样测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素（Car）、丙二醛（MDA）含量及过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和Cd的亚细胞分布。水培10 d后进行终期采样，测量根长和茎长，根、茎和叶的鲜重及干重，测定重金属Cd含量。
1.3 测定方法
1.3.1 生理生化指标 采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量（赵世杰等，2002）;丙酮提取法测定叶绿素含量（张志良和翟伟菁，2004）;氮蓝四唑（NBT）还原法测定SOD活性（李合生，2000）;愈创木酚显色法测定POD活性（李合生，2000）。
1.3.2 重金属Cd含量测定 分别对根、茎和叶进行混合取样，粉碎过0.425 mm筛。称取样品2.0 g放入消解管中，浓硝酸和高氯酸分别添加20 mL和4 mL，然后低温热销解。当溶液到4 mL左右时，添加10 mL超纯水，继续消解13 min左右，转移至25 mL容量瓶中，冷却至室温，以0.2%的硝酸定容，使用原子吸收分光光度计（美220FS）分析其中Cd含量（鲍士旦，2007），并计算Cd转运速率、吸收速率和单株地上部对Cd的净化率（冉烈等，2012）。
Cd轉运速率=单株地上部富集Cd量/根系干重/10 d;Cd吸收速率=单株富集Cd量/根系干重/10 d;10 d内单株地上部对Cd的净化率=单株地上部富集Cd的量/水中全Cd量×100%;10 d内整盆植株在单位体积内对Cd的净化率=整盆植株富集Cd的量/水中全Cd量/水培体积×100%，其中，水中全Cd量=水培盆中水的体积×Cd浓度。
1.3.3 Cd的亚细胞分布 取嫩叶1 g，置于10 mL预冷的匀浆液中研磨匀浆。匀浆液组成：250 mmol·L-1 蔗糖，50 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4），1 mmol·L-1 二硫赤藓糖醇（C4H10O2S2）。匀浆后，进行差速离心，依次为600 r·min-1 下10 min沉淀为细胞壁，1 000 r·min-1 下15 min沉淀为叶绿体以及10 000 r·min-1下20 min沉淀为线粒体，上层溶液为胞质组分（含液泡，核糖等），每次离心重复进行3次（汤惠华等，2008）。 1.4 数据处理
采用Excel软件进行数据处理，计算均值，方差等和制图。用SPSS 22.0软件进行组间单因素方差分析，多重比较采用Duncan法（α=0.05）。
2 结果与分析
2.1 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗根长、茎长和生物量的影响
紫花苜蓿幼苗根长和茎长随着Cd浓度的增大均先增加后减小。0.125 mmol·L-1 Cd处理使茎长和根长显著增加（P<0.05），与CK相比分别增加了7.35%和11.00%。随着Cd浓度的进一步增大，茎长和根长依次减小，2.0 mmol·L-1 Cd处理分别比CK减少了47.47%和58.18%（P<0.05）（图1：A）。Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗的干重与CK相比无显著差异，但Cd胁迫使幼苗的鲜重和含水量显著降低（P<0.05），降低幅度随Cd胁迫浓度的加大而增大。2.0 mmol·L-1 Cd处理后的幼苗鲜重和含水量分别比CK下降59.91%和24.1%（图1：B）。
2.2 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗叶片中叶绿素与类胡萝卜素含量的影响
Cd浓度为0.125 mmol·L-1时，紫花苜蓿幼苗叶中叶绿素a、叶绿素b和Car含量与CK相比无显著差异（P>0.05），而随着Cd处理浓度增加，叶绿素a、叶绿素b和Car含量明显下降，其中在Cd浓度为2.0 mmol·L-1降至最低，分别仅为CK的47.01%、72.27%和51.28%（P<0.05）。叶绿素a/b值随Cd处理浓度的增加持续下降（表1）。
2.3 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗MDA含量与抗氧化酶的影响
紫花苜蓿幼苗体内的MDA含量经不同浓度Cd处理后显著提高（P<0.05），其中，在Cd处理浓随着Cd处理浓度的增大，紫花苜蓿根、茎和叶中SOD活性总体呈现先增强后减弱的趋势。其中，当Cd处理浓度为0.125 mmol·L-1时，茎中的SOD活性略大于根和叶中，但相较于CK，根中SOD活性显著降低（P<0.05），而茎和叶中的SOD活性则略微升高（P>0.05）。而Cd处理浓度为0.5 mmol·L-1时根和茎中SOD活性达最强，Cd处理为0.25 mmol·L-1时叶中SOD活性达最强，与CK相比分别增强了55.27%、45.90%、100.28%（P<0.05）;而Cd处理为2.0 mmol·L-1时，茎、叶中SOD活性被显著抑制（P<0.05），根中则与CK大致持平（P>0.05）（图3：A）。紫花苜蓿幼苗根、茎和叶中POD的活性在Cd处理浓度为0.125 mmol·L-1時均显著高于CK，其中根中的POD活性显著高于茎和叶中的活性（P<0.05）。继续增加Cd处理浓度，POD变化趋势与SOD大致相似，0.5、1.0、0.25 mmol·L-1 Cd处理分别使根、茎、叶中POD达最强，对比CK分别增强了71.75%、96.60%、54.13%（P<0.05）;而随着Cd浓度进一步增大，根、茎和叶中POD活性虽较最大值有所减少，但仍显著高于CK（P<0.05）（图3：B）。
2.4 Cd在紫花苜蓿幼苗叶片内的亚细胞分布
紫花苜蓿叶片亚细胞组分内Cd的含量大小不一，而细胞壁内的Cd含量最高，占总量的53.71%～61.85%;其次为细胞质，占总量的19.51%～31.68%;再次是线粒体，占总量的8.85%～17.07%;而叶绿体中Cd含量较少，仅占总量的2.44%～7.87%。叶片各亚细胞组分Cd含量随Cd浓度升高而显著增加（P<0.05）。对比CK，叶片内的全Cd量增加了43.17倍，而细胞壁、叶绿体、线粒体、细胞质中Cd含量与CK相比最大增加的倍数分别为38.03、100.52、22.75、69.97（P<0.05）（表2）。
2.5 紫花苜蓿幼苗对Cd的积累和转运
不同浓度Cd处理后，紫花苜蓿地上部（茎、叶）与地下部（根）均在不同程度上积累了Cd。随着Cd处理浓度的增大，其积累量显著增加（P<0.05）。当Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时，紫花苜蓿积累Cd量达最高，而随着Cd处理浓度的增加，10 d内单株地上部对Cd的净化率及整盆植株在单位体积内对Cd的净化率则依次降低，其中浓度为0.125 mmol·L-1的Cd处理时净化率最高，相当于平均每株从水中带走的Cd占水中全Cd含量的0.214%，每盆中全部植株从单位体积的Cd溶液中吸收的Cd占水中全Cd含量的15.5%。而紫花苜蓿体内Cd的吸收速率和转运速率则随着Cd处理浓度的增大呈现依次增高的趋势，在Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时达最高值，分别为8.774和16.190 μmol·g-1·d-1（表3）。
3 讨论与结论
重金属的积累会影响植物的正常生理过程，抑制植株生长，使生物量降低（徐苏凌等，2008）。
一般认为，低浓度Cd能刺激种子萌发及幼苗生长而较高浓度的Cd则对其有抑制的效应（张春容等，2004）。本研究中，0.125 mmol·L-1 Cd处理使茎长和根长显著增加，而随着Cd浓度的进一步增大，茎长和根长依次减小，导致植株明显低矮。同时，Cd胁迫下植株幼苗的干重与CK无显著差异，而鲜重和含水量随Cd浓度增大而显著降低，其中2.0 mmol·L-1 Cd处理使植株鲜重和含水量降至最低。由于植物体内的绝大多数代谢活动都是在水介质中进行的，而且水分也是某些植物代谢过程中重要的反应物质，所以含水量减少影响了紫花苜蓿幼苗正常的生理代谢，导致幼苗干枯。这与Adamakis et al.（2014）研究结果相同，进一步证明植物过量吸收Cd会影响其正常的生长发育。 光合作用是植物转化光能为化学能的基础生理活动，叶绿素作为光合作用的关键色素，其含量多少标志着植物生长能力的强弱（汤惠华等，2008）。本研究中，紫花苜蓿幼苗叶片中叶绿素含量与其根长、茎长的变化趋势相似，低浓度Cd处理使叶中叶绿素a、叶绿素b和Car含量较CK均有所增加，但继续升高Cd的浓度时，叶绿素a、叶绿素b和Car的含量则显著减少，这与汤惠华等（2008）的研究结果一致。Cd被植物吸收固定时引起ROS大量积累（生吉萍等，2009），ROS能抑制叶绿素和Car合成相关酶的活性以及加速叶绿素和Car的降解，从而使叶绿素与Car含量降低。叶绿素a、叶绿素b都能够捕获和传递光能，但只有少数特殊状态下的叶绿素a具有将光能转变为化学能的功能（孙小玲等，2010），本研究中Cd处理使叶绿素a/b值降低，说明Cd对叶绿素a的影响大于叶绿素b，本实验在光照充足的条件下进行，叶绿素a含量的变化更能影响紫花苜蓿的光合作用。Car行使光能捕获和光破坏防御功能（孙小玲等，2010），Cd胁迫下Car含量降低，导致紫花苜蓿幼苗捕获光能不足而影响光合效率，抵御光氧化伤害的能力减弱而损伤光合机构（Demmig-Adams & Adams，2000;Matsubara et al.，2008），这进一步说明Cd胁迫能导致紫花苜蓿幼苗光合作用减弱并抑制其生长。
与项目组前期研究结果一致（蘧苗苗等，2016），本研究中，紫花苜蓿根、茎、叶中MDA含量均随Cd浓度的升高而增加，且显著高于CK，而其抗氧化酶系统中的SOD与POD活性则整体呈现先升高再随Cd处理浓度增大而降低的趋势。其中，在低浓度Cd胁迫（0.125 mmol·L-1）下，根中MDA显著高于茎和叶，说明直接接触Cd胁迫的根组织与茎和叶相比，细胞膜受损更严重;根中的SOD活性则显著低于CK，茎和叶中的SOD活性与CK无显著差异，说明低浓度Cd胁迫抑制了根中SOD的活性，而根、茎、叶中POD的活性均显著高于CK，说明紫花苜蓿在受到低浓度Cd胁迫时，POD能被激活以及时清除ROS;根中的POD活性显著高于茎和叶中的活性，说明低浓度Cd胁迫下与Cd直接接触的根部组织中POD活性变化更为迅速和激烈。在高浓度（1.5～2.0 mmol·L-1）Cd胁迫下，根中POD和SOD活性虽较最大值有所下降，但仍显著高于CK，特别是根中的SOD被显著激活，协同POD清除根中ROS，减轻高浓度Cd造成的膜脂过氧化损伤，相应的根中MDA含量则显著下降，说明植物抵抗Cd胁迫过程中抗氧化酶系统的各种酶是相互协调配合起作用，而不只是由于某個酶的活性变化就可以起到抗氧化效果（高福元等，2010）;虽然茎中SOD活性低于根和叶，但POD活性居中，可以清除部分ROS，而且，由于茎中的细胞壁果胶和半纤维含量较高，使Cd沉积在细胞壁中解毒，大大缓解了Cd对茎的毒害作用，从而使MDA含量低于根和叶（周翠等，2017）;而叶中MDA含量显著高于根和茎，导致膜的损伤和破坏，造成叶片内重要的活性氧清除酶SOD 和POD活性降低，特别是POD活性，表明高度积累的MDA 对于 SOD 和POD的活性起抑制作用（朱涵毅等，2013）。说明Cd在同一植株的不同部位导致膜脂过氧化程度不同，而且抗氧化酶在同一植株不同部位以及不同浓度Cd胁迫下被激活的速度与程度也有差别，这种差异可能与植物的器官及酶的种类有关（尹国丽等，2013）。
植物可通过调整 Cd在亚细胞组分中的分配实现对Cd毒害的适应（汤惠华等，2008）。本研究中，Cd在各组分中的含量分配排序为细胞壁>细胞质>线粒体>叶绿体。这与Wang et al.（2008）研究结果一致。表明Cd大部分分布于细胞壁中，细胞壁中的多糖分子和蛋白质分子能结合Cd2+，使Cd沉淀在细胞壁中，阻挡一些Cd进入细胞内部，从而降低Cd对植物造成的毒害（Kupper et al.，2000;李红婷和董然，2015）。高浓度Cd胁迫下叶绿体和细胞质内的Cd含量分配增加，细胞壁和线粒体内的Cd含量分配减少。说明此时细胞壁对Cd的滞留作用减弱，更多的Cd进入细胞内部并产生影响，本研究中，叶片各亚细胞组分Cd含量随着Cd浓度的升高均显著增加，而与CK比较，叶绿体增加的倍数最大（100.52倍）。作为植物细胞内双层膜结构的关键细胞器，叶绿体和线粒体代谢活跃，功能性强，特别是对于叶绿体来说，Cd含量的激增能破坏类囊体，甚至于破坏双层膜结构导致叶绿体基质外流和解体（吴建慧等，2016），且光合作用相关的色素位于类囊体膜的蛋白质复合体中（孙小玲等，2010），所以，过量的Cd进入叶绿体中会对其结构和功能产生严重的破坏作用。与此同时，如前所述，Cd胁迫下大量积累的ROS使叶绿素和Car合成酶活性受到抑制，叶绿素和Car的降解加速，导致叶绿素与Car含量降低，这进一步加深了Cd对紫花苜蓿幼苗的毒害作用。有研究表明（Allan & Jarrell，1989）当细胞壁对Cd的贮藏能力达到饱和时，Cd会被转运到细胞质中，而细胞壁与细胞质是细胞中代谢不活跃区域，且细胞质内的部分小分子化合物能结合Cd形成沉淀，对Cd具有一定的耐受性。因此，尽管Cd在叶绿体中的含量很少，但对比CK却是成倍激增，相比细胞中的其他组分受到的损伤却是最严重的。
紫花苜蓿地上部和地下部的Cd含量、Cd的吸收和转运速率伴随Cd胁迫浓度的增加均显著升高，表明在本研究的浓度梯度内，紫花苜蓿吸附积累Cd离子的量随着胁迫浓度增大而逐渐增加，对Cd的吸收及转运速率也持续增大，过量Cd积累导致植株进一步受到损伤。而低浓度下，地下部的Cd含量始终高于地上部的，这是由于根部最先接触Cd胁迫，交换吸附的量比较多，而这与Kupper et al.（2000）的研究结果一致;而只有少量的Cd离子经过根部后运输到了茎和叶，故紫花苜蓿地上部的Cd含量相对较低。在1.0 mmol·L-1 Cd胁迫之后，地下部的Cd离子的吸附量已近饱和，植株对Cd的吸收及转运速率趋于平缓，紫花苜蓿幼苗出现叶片枯黄萎缩的现象，部分幼苗已接近死亡，说明此时紫花苜蓿吸收及转运Cd离子的量已经接近极限，严重影响了紫花苜蓿体内各种生理代谢。Baker & Brooks（1989）认为地上部对Cd富集达100 μg·g-1为Cd超富集植物的临界标准含量，另外还需具备较好的生长抗性。在本研究中，当Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时，紫花苜蓿幼苗地上部Cd含量达89.36 μg·g-1;Cd处理浓度为0.125 mmol·L-1时，10 d内紫花苜蓿幼苗单株地上部对Cd的净化率最高，达到 0.214%。本研究中，培养10 d的紫花苜蓿虽未达到Cd超富集植物的临界标准，但紫花苜蓿对Cd的富集量为89.36 μg·g-1，与相关研究中培养105 d的苦草（Vallisneria natans）对Cd的富集量为90 mg·kg-1（乔云蕾等，2016）相似;单株地上部对Cd的最大净化率为0.214%，与芥菜型油菜（Brassica juncea）培养30 d对Cr的净化率为0.23%（王爱云等，2011）及培养66 d对Zn和Cd的净化率分别为0.29%和0.13% （蒋先军等，2002）相似。因此，从植株富集Cd量，耐Cd程度及对Cd的净化率等方面对比考虑，紫花苜蓿在Cd污染土壤的植物修复中具有一定的应用价值。 参考文献：
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关键词：镉胁迫，紫花苜蓿，生理特性，镉富集，镉污染
Abstract：Taking seedlings of alfalfa variety ‘Medicago sativa cv. Gannong No. 3’，we studied the effects of Cd stress on the length of stem and root，biomass，the contents of chlorophyll and malonyldialdehyde （MDA），the activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxide enzyme （POD），Cd enrichment and Cd subcellular distribution in leaf of alfalfa seedlings under Cd stress with concentration between 0 to 20 mol·L-1 for 10 d. The results showed that length of stem and root，chlorophyll content increased under lower Cd concentration （0.125 mmol·L-1） stress. However，lower length of stem and root，biomass and chlorophyll content were observed under the higher Cd concentration （0.5～2.0 mmol·L-1） stress. Accumulation of reactive oxygen species（ROS） in alfalfa seedlings under Cd stress caused membrane lipid system peroxidation，MDA content increased significantly，while the activity of SOD and POD was significantly enhanced. When the concentration of Cd stress was 0.5 mmol·L-1，the activity of SOD and POD reached the maximum，which may be a protective reaction of plants to environmental stress，antioxidant enzyme system was started up to remove ROS accumulated during Cd stress and to mitigate membrane lipid peroxidation damage caused by Cd stress. Subcellular distribution of Cd in leaf was in the order of cell wall，cytoplasm，mitochondria，chloroplast，and the content of Cd in each subcellular fraction increased with the concentration increase of Cd stress. When the concentration of Cd was 0.125 mmol·L-1，purification rate of Cd in the shoots of individual plants grown in nutrient solution for 10 d up to 0.214%，and the purification rate of Cd for whole pot plant per unit volume up to 15.5%. When the concentration of Cd was 2.0 mmol·L-1，the content of Cd in the aboveground part of alfalfa seedlings was 89.36 μg·g-1. Those results suggest that alfalfa has a very strong enrichment ability for Cd，although it does not meet the critical criteria for Cd-rich plants. However，alfalfa has a good application value in the phytoremediation of Cd-contaminated soil，considering the plant biomass，Cd tolerance，Cd enrichment，and purification rate of Cd. Key words：Cd stress，alfalfa，physiological characteristics，Cd enrichment，Cd pollution
镉（cadmium，Cd）以硫镉矿的形式存在自然界中，近年来，随着采矿、电镀、冶金等工业活动产生的“三废”排放，导致大量Cd进入自然环境，大面积土壤被污染，形势十分严峻（Hawrylak et al.，2014;Reiser et al.，2014;陈永勤等，2015）。Cd具有毒性大、容易转移、降解困难且分解周期极长等特点，在农业生产中被农作物吸收后，除了会破坏植物的生理活动，导致其产量和质量低下外，还会被人摄取危害健康（李婧等，2015;申强等，2015）。所以，Cd污染土壤的修复已成为土壤学、生态学和环境科学等学科的研究热点和难点。
利用超富集植物吸附重金属的特性修复Cd污染土壤的方法，由于其操作简单便捷、费用少、环境友好、且可大规模实施等优点而日益受到世界研究者的重视（马彩云等，2013）。然而在自然界中具有超富集特性的植物类别很少，多数生长慢、产量低，而且只在少数地区分布。因此，从超富集植物资源中筛选生长迅速且产量高的植物成为植物修复技术的一条新思路。紫花苜蓿（Medicago sativa）是全球范围内普遍种植的草本植物，其生长快、适应能力好、根系发达、枝叶繁多、生物学产量高，在牧草业被认为是牧草之最（徐苏凌等，2008;陈银萍等，2015）。已有报道显示土壤中Cu、Zn等重金属可以被紫花苜蓿吸收富集（蘧苗苗等，2016;王文星等，2006;代惠萍等，2014;刘菊梅等，2018）。目前，关于紫花苜蓿的报道多数集中在对盐和干旱胁迫的响应（李文娆等，2010;张立全等，2012）以及重金属胁迫下种子萌发与幼苗生长及生理特性等方面（曹婷和代惠萍，2014;蘧苗苗等，2016），而紫花苜蓿对重金属Cd富集特性和Cd污染土壤修复的研究则比较缺乏。
Cd胁迫能引起植株的生理生化产生一系列的变化。长期Cd胁迫会导致细胞内活性氧（ROS）累积，进一步引起氧化胁迫，使植物根系活力下降，植物生长受抑制，叶绿素分解，植物叶片发黄干枯等（Smeets et al.，2005;王松华等，2011;尹国丽等，2013）。而抗氧化系统可以调节细胞内的ROS水平，减少对植物造成的损害（Francisco & José，2011;江玲等，2014）。本研究以紫花苜蓿幼苗为材料，分析了不同浓度Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗的生物量、光合色素、膜脂过氧化、抗氧化及Cd累积特性，探究紫花苜蓿在镉胁迫下的生长情况以及对Cd的积累，以期为阐明紫花苜蓿受镉毒害的机制与修复镉污染土壤给出指导。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
以“甘农三号”（Gannong No.3）紫花苜蓿作为实验材料，选购于甘肃农科院。Cd胁迫用5/2水合氯化镉（国药试剂），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
挑选大小均一的紫花苜蓿种子，为提高其发芽率，将种子置于温蒸馏水（50～60 ℃）中0.5 h。种子取出晾干后播种在含有1/2浓度Hoagland’s营养液的生长介质中，于室内培养架中发芽生长，共24盆，定期更换生长介质。培养30 d左右，待幼苗长出约3片叶时，挑选大小相似的21盆，分成7组，Cd胁迫试剂为CdCl2，Cd浓度梯度为0（CK）、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L-1，继续水培3 d后（水培体积为500 mL），分别对根、茎和叶进行混合取样，鲜样测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素（Car）、丙二醛（MDA）含量及过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和Cd的亚细胞分布。水培10 d后进行终期采样，测量根长和茎长，根、茎和叶的鲜重及干重，测定重金属Cd含量。
1.3 测定方法
1.3.1 生理生化指标 采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量（赵世杰等，2002）;丙酮提取法测定叶绿素含量（张志良和翟伟菁，2004）;氮蓝四唑（NBT）还原法测定SOD活性（李合生，2000）;愈创木酚显色法测定POD活性（李合生，2000）。
1.3.2 重金属Cd含量测定 分别对根、茎和叶进行混合取样，粉碎过0.425 mm筛。称取样品2.0 g放入消解管中，浓硝酸和高氯酸分别添加20 mL和4 mL，然后低温热销解。当溶液到4 mL左右时，添加10 mL超纯水，继续消解13 min左右，转移至25 mL容量瓶中，冷却至室温，以0.2%的硝酸定容，使用原子吸收分光光度计（美220FS）分析其中Cd含量（鲍士旦，2007），并计算Cd转运速率、吸收速率和单株地上部对Cd的净化率（冉烈等，2012）。
Cd轉运速率=单株地上部富集Cd量/根系干重/10 d;Cd吸收速率=单株富集Cd量/根系干重/10 d;10 d内单株地上部对Cd的净化率=单株地上部富集Cd的量/水中全Cd量×100%;10 d内整盆植株在单位体积内对Cd的净化率=整盆植株富集Cd的量/水中全Cd量/水培体积×100%，其中，水中全Cd量=水培盆中水的体积×Cd浓度。
1.3.3 Cd的亚细胞分布 取嫩叶1 g，置于10 mL预冷的匀浆液中研磨匀浆。匀浆液组成：250 mmol·L-1 蔗糖，50 mmol·L-1 Tris-HCl （pH 7.4），1 mmol·L-1 二硫赤藓糖醇（C4H10O2S2）。匀浆后，进行差速离心，依次为600 r·min-1 下10 min沉淀为细胞壁，1 000 r·min-1 下15 min沉淀为叶绿体以及10 000 r·min-1下20 min沉淀为线粒体，上层溶液为胞质组分（含液泡，核糖等），每次离心重复进行3次（汤惠华等，2008）。 1.4 数据处理
采用Excel软件进行数据处理，计算均值，方差等和制图。用SPSS 22.0软件进行组间单因素方差分析，多重比较采用Duncan法（α=0.05）。
2 结果与分析
2.1 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗根长、茎长和生物量的影响
紫花苜蓿幼苗根长和茎长随着Cd浓度的增大均先增加后减小。0.125 mmol·L-1 Cd处理使茎长和根长显著增加（P<0.05），与CK相比分别增加了7.35%和11.00%。随着Cd浓度的进一步增大，茎长和根长依次减小，2.0 mmol·L-1 Cd处理分别比CK减少了47.47%和58.18%（P<0.05）（图1：A）。Cd胁迫下紫花苜蓿幼苗的干重与CK相比无显著差异，但Cd胁迫使幼苗的鲜重和含水量显著降低（P<0.05），降低幅度随Cd胁迫浓度的加大而增大。2.0 mmol·L-1 Cd处理后的幼苗鲜重和含水量分别比CK下降59.91%和24.1%（图1：B）。
2.2 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗叶片中叶绿素与类胡萝卜素含量的影响
Cd浓度为0.125 mmol·L-1时，紫花苜蓿幼苗叶中叶绿素a、叶绿素b和Car含量与CK相比无显著差异（P>0.05），而随着Cd处理浓度增加，叶绿素a、叶绿素b和Car含量明显下降，其中在Cd浓度为2.0 mmol·L-1降至最低，分别仅为CK的47.01%、72.27%和51.28%（P<0.05）。叶绿素a/b值随Cd处理浓度的增加持续下降（表1）。
2.3 Cd胁迫对紫花苜蓿幼苗MDA含量与抗氧化酶的影响
紫花苜蓿幼苗体内的MDA含量经不同浓度Cd处理后显著提高（P<0.05），其中，在Cd处理浓随着Cd处理浓度的增大，紫花苜蓿根、茎和叶中SOD活性总体呈现先增强后减弱的趋势。其中，当Cd处理浓度为0.125 mmol·L-1时，茎中的SOD活性略大于根和叶中，但相较于CK，根中SOD活性显著降低（P<0.05），而茎和叶中的SOD活性则略微升高（P>0.05）。而Cd处理浓度为0.5 mmol·L-1时根和茎中SOD活性达最强，Cd处理为0.25 mmol·L-1时叶中SOD活性达最强，与CK相比分别增强了55.27%、45.90%、100.28%（P<0.05）;而Cd处理为2.0 mmol·L-1时，茎、叶中SOD活性被显著抑制（P<0.05），根中则与CK大致持平（P>0.05）（图3：A）。紫花苜蓿幼苗根、茎和叶中POD的活性在Cd处理浓度为0.125 mmol·L-1時均显著高于CK，其中根中的POD活性显著高于茎和叶中的活性（P<0.05）。继续增加Cd处理浓度，POD变化趋势与SOD大致相似，0.5、1.0、0.25 mmol·L-1 Cd处理分别使根、茎、叶中POD达最强，对比CK分别增强了71.75%、96.60%、54.13%（P<0.05）;而随着Cd浓度进一步增大，根、茎和叶中POD活性虽较最大值有所减少，但仍显著高于CK（P<0.05）（图3：B）。
2.4 Cd在紫花苜蓿幼苗叶片内的亚细胞分布
紫花苜蓿叶片亚细胞组分内Cd的含量大小不一，而细胞壁内的Cd含量最高，占总量的53.71%～61.85%;其次为细胞质，占总量的19.51%～31.68%;再次是线粒体，占总量的8.85%～17.07%;而叶绿体中Cd含量较少，仅占总量的2.44%～7.87%。叶片各亚细胞组分Cd含量随Cd浓度升高而显著增加（P<0.05）。对比CK，叶片内的全Cd量增加了43.17倍，而细胞壁、叶绿体、线粒体、细胞质中Cd含量与CK相比最大增加的倍数分别为38.03、100.52、22.75、69.97（P<0.05）（表2）。
2.5 紫花苜蓿幼苗对Cd的积累和转运
不同浓度Cd处理后，紫花苜蓿地上部（茎、叶）与地下部（根）均在不同程度上积累了Cd。随着Cd处理浓度的增大，其积累量显著增加（P<0.05）。当Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时，紫花苜蓿积累Cd量达最高，而随着Cd处理浓度的增加，10 d内单株地上部对Cd的净化率及整盆植株在单位体积内对Cd的净化率则依次降低，其中浓度为0.125 mmol·L-1的Cd处理时净化率最高，相当于平均每株从水中带走的Cd占水中全Cd含量的0.214%，每盆中全部植株从单位体积的Cd溶液中吸收的Cd占水中全Cd含量的15.5%。而紫花苜蓿体内Cd的吸收速率和转运速率则随着Cd处理浓度的增大呈现依次增高的趋势，在Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时达最高值，分别为8.774和16.190 μmol·g-1·d-1（表3）。
3 讨论与结论
重金属的积累会影响植物的正常生理过程，抑制植株生长，使生物量降低（徐苏凌等，2008）。
一般认为，低浓度Cd能刺激种子萌发及幼苗生长而较高浓度的Cd则对其有抑制的效应（张春容等，2004）。本研究中，0.125 mmol·L-1 Cd处理使茎长和根长显著增加，而随着Cd浓度的进一步增大，茎长和根长依次减小，导致植株明显低矮。同时，Cd胁迫下植株幼苗的干重与CK无显著差异，而鲜重和含水量随Cd浓度增大而显著降低，其中2.0 mmol·L-1 Cd处理使植株鲜重和含水量降至最低。由于植物体内的绝大多数代谢活动都是在水介质中进行的，而且水分也是某些植物代谢过程中重要的反应物质，所以含水量减少影响了紫花苜蓿幼苗正常的生理代谢，导致幼苗干枯。这与Adamakis et al.（2014）研究结果相同，进一步证明植物过量吸收Cd会影响其正常的生长发育。 光合作用是植物转化光能为化学能的基础生理活动，叶绿素作为光合作用的关键色素，其含量多少标志着植物生长能力的强弱（汤惠华等，2008）。本研究中，紫花苜蓿幼苗叶片中叶绿素含量与其根长、茎长的变化趋势相似，低浓度Cd处理使叶中叶绿素a、叶绿素b和Car含量较CK均有所增加，但继续升高Cd的浓度时，叶绿素a、叶绿素b和Car的含量则显著减少，这与汤惠华等（2008）的研究结果一致。Cd被植物吸收固定时引起ROS大量积累（生吉萍等，2009），ROS能抑制叶绿素和Car合成相关酶的活性以及加速叶绿素和Car的降解，从而使叶绿素与Car含量降低。叶绿素a、叶绿素b都能够捕获和传递光能，但只有少数特殊状态下的叶绿素a具有将光能转变为化学能的功能（孙小玲等，2010），本研究中Cd处理使叶绿素a/b值降低，说明Cd对叶绿素a的影响大于叶绿素b，本实验在光照充足的条件下进行，叶绿素a含量的变化更能影响紫花苜蓿的光合作用。Car行使光能捕获和光破坏防御功能（孙小玲等，2010），Cd胁迫下Car含量降低，导致紫花苜蓿幼苗捕获光能不足而影响光合效率，抵御光氧化伤害的能力减弱而损伤光合机构（Demmig-Adams & Adams，2000;Matsubara et al.，2008），这进一步说明Cd胁迫能导致紫花苜蓿幼苗光合作用减弱并抑制其生长。
与项目组前期研究结果一致（蘧苗苗等，2016），本研究中，紫花苜蓿根、茎、叶中MDA含量均随Cd浓度的升高而增加，且显著高于CK，而其抗氧化酶系统中的SOD与POD活性则整体呈现先升高再随Cd处理浓度增大而降低的趋势。其中，在低浓度Cd胁迫（0.125 mmol·L-1）下，根中MDA显著高于茎和叶，说明直接接触Cd胁迫的根组织与茎和叶相比，细胞膜受损更严重;根中的SOD活性则显著低于CK，茎和叶中的SOD活性与CK无显著差异，说明低浓度Cd胁迫抑制了根中SOD的活性，而根、茎、叶中POD的活性均显著高于CK，说明紫花苜蓿在受到低浓度Cd胁迫时，POD能被激活以及时清除ROS;根中的POD活性显著高于茎和叶中的活性，说明低浓度Cd胁迫下与Cd直接接触的根部组织中POD活性变化更为迅速和激烈。在高浓度（1.5～2.0 mmol·L-1）Cd胁迫下，根中POD和SOD活性虽较最大值有所下降，但仍显著高于CK，特别是根中的SOD被显著激活，协同POD清除根中ROS，减轻高浓度Cd造成的膜脂过氧化损伤，相应的根中MDA含量则显著下降，说明植物抵抗Cd胁迫过程中抗氧化酶系统的各种酶是相互协调配合起作用，而不只是由于某個酶的活性变化就可以起到抗氧化效果（高福元等，2010）;虽然茎中SOD活性低于根和叶，但POD活性居中，可以清除部分ROS，而且，由于茎中的细胞壁果胶和半纤维含量较高，使Cd沉积在细胞壁中解毒，大大缓解了Cd对茎的毒害作用，从而使MDA含量低于根和叶（周翠等，2017）;而叶中MDA含量显著高于根和茎，导致膜的损伤和破坏，造成叶片内重要的活性氧清除酶SOD 和POD活性降低，特别是POD活性，表明高度积累的MDA 对于 SOD 和POD的活性起抑制作用（朱涵毅等，2013）。说明Cd在同一植株的不同部位导致膜脂过氧化程度不同，而且抗氧化酶在同一植株不同部位以及不同浓度Cd胁迫下被激活的速度与程度也有差别，这种差异可能与植物的器官及酶的种类有关（尹国丽等，2013）。
植物可通过调整 Cd在亚细胞组分中的分配实现对Cd毒害的适应（汤惠华等，2008）。本研究中，Cd在各组分中的含量分配排序为细胞壁>细胞质>线粒体>叶绿体。这与Wang et al.（2008）研究结果一致。表明Cd大部分分布于细胞壁中，细胞壁中的多糖分子和蛋白质分子能结合Cd2+，使Cd沉淀在细胞壁中，阻挡一些Cd进入细胞内部，从而降低Cd对植物造成的毒害（Kupper et al.，2000;李红婷和董然，2015）。高浓度Cd胁迫下叶绿体和细胞质内的Cd含量分配增加，细胞壁和线粒体内的Cd含量分配减少。说明此时细胞壁对Cd的滞留作用减弱，更多的Cd进入细胞内部并产生影响，本研究中，叶片各亚细胞组分Cd含量随着Cd浓度的升高均显著增加，而与CK比较，叶绿体增加的倍数最大（100.52倍）。作为植物细胞内双层膜结构的关键细胞器，叶绿体和线粒体代谢活跃，功能性强，特别是对于叶绿体来说，Cd含量的激增能破坏类囊体，甚至于破坏双层膜结构导致叶绿体基质外流和解体（吴建慧等，2016），且光合作用相关的色素位于类囊体膜的蛋白质复合体中（孙小玲等，2010），所以，过量的Cd进入叶绿体中会对其结构和功能产生严重的破坏作用。与此同时，如前所述，Cd胁迫下大量积累的ROS使叶绿素和Car合成酶活性受到抑制，叶绿素和Car的降解加速，导致叶绿素与Car含量降低，这进一步加深了Cd对紫花苜蓿幼苗的毒害作用。有研究表明（Allan & Jarrell，1989）当细胞壁对Cd的贮藏能力达到饱和时，Cd会被转运到细胞质中，而细胞壁与细胞质是细胞中代谢不活跃区域，且细胞质内的部分小分子化合物能结合Cd形成沉淀，对Cd具有一定的耐受性。因此，尽管Cd在叶绿体中的含量很少，但对比CK却是成倍激增，相比细胞中的其他组分受到的损伤却是最严重的。
紫花苜蓿地上部和地下部的Cd含量、Cd的吸收和转运速率伴随Cd胁迫浓度的增加均显著升高，表明在本研究的浓度梯度内，紫花苜蓿吸附积累Cd离子的量随着胁迫浓度增大而逐渐增加，对Cd的吸收及转运速率也持续增大，过量Cd积累导致植株进一步受到损伤。而低浓度下，地下部的Cd含量始终高于地上部的，这是由于根部最先接触Cd胁迫，交换吸附的量比较多，而这与Kupper et al.（2000）的研究结果一致;而只有少量的Cd离子经过根部后运输到了茎和叶，故紫花苜蓿地上部的Cd含量相对较低。在1.0 mmol·L-1 Cd胁迫之后，地下部的Cd离子的吸附量已近饱和，植株对Cd的吸收及转运速率趋于平缓，紫花苜蓿幼苗出现叶片枯黄萎缩的现象，部分幼苗已接近死亡，说明此时紫花苜蓿吸收及转运Cd离子的量已经接近极限，严重影响了紫花苜蓿体内各种生理代谢。Baker & Brooks（1989）认为地上部对Cd富集达100 μg·g-1为Cd超富集植物的临界标准含量，另外还需具备较好的生长抗性。在本研究中，当Cd处理浓度为2.0 mmol·L-1时，紫花苜蓿幼苗地上部Cd含量达89.36 μg·g-1;Cd处理浓度为0.125 mmol·L-1时，10 d内紫花苜蓿幼苗单株地上部对Cd的净化率最高，达到 0.214%。本研究中，培养10 d的紫花苜蓿虽未达到Cd超富集植物的临界标准，但紫花苜蓿对Cd的富集量为89.36 μg·g-1，与相关研究中培养105 d的苦草（Vallisneria natans）对Cd的富集量为90 mg·kg-1（乔云蕾等，2016）相似;单株地上部对Cd的最大净化率为0.214%，与芥菜型油菜（Brassica juncea）培养30 d对Cr的净化率为0.23%（王爱云等，2011）及培养66 d对Zn和Cd的净化率分别为0.29%和0.13% （蒋先军等，2002）相似。因此，从植株富集Cd量，耐Cd程度及对Cd的净化率等方面对比考虑，紫花苜蓿在Cd污染土壤的植物修复中具有一定的应用价值。 参考文献：
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