【摘 要】
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[目的]制备Ⅱ型鲤疱疹病毒(CyHV-2)ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持.[方法]利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析Cy-HV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白.以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/
【机 构】
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国家水生动物病原库/农业农村部淡水种质资源重点实验室/水产科学国家级实验教学示范中心/上海海洋大学,上海 201306
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[目的]制备Ⅱ型鲤疱疹病毒(CyHV-2)ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持.[方法]利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析Cy-HV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白.以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性.[结果]CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00％,其中与Cy-HV-3的相似性高达39.36％;其抗原表位最可能存在于第1～300位氨基酸序列中.将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL.以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞(GiCF);利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2.[结论]制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与Cy-HV-2潜伏感染相关打下了基础.
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