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摘 要：本文对胡桃楸茎皮的生长期及休眠期5～11月过氧化物酶（POD）同工酶进行测定分析，结果显示：胡桃楸茎皮POD同工酶表达丰富，酶活性强，酶带清晰稳定；茎皮POD同工酶表达具阶段特异性；同工酶分析适合采用茎皮部；试验结果为进一步探索次生代谢产物积累与POD活性大小及同工酶谱带数的消长关系，为核桃楸药源的合理、高效开发提供生化参考依据。
关键词：胡桃楸茎皮；POD；同工酶
中图分类号：R284.1 文献标识码：A
胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim）又名山核桃、核桃楸、胡桃、小核桃等，为胡桃科胡桃属落叶乔木。为珍贵用材，也是著名的药用植物。目前，有关胡桃楸茎皮药效及药用成分研究的报道较多，且偏重于其抗性研究，而对胡桃楸POD同工酶的研究较少。本试验通过对胡桃楸茎皮的POD同工酶进行生长期比较和分析，旨在揭示胡桃楸同工酶谱带的变化规律，为更好地了解山核桃生长期特点，探讨山核桃生理代谢、发育特点与同工酶谱带的关系，为促进胡桃楸食药用开发利用提供生化水平参考。并试图为进一步探讨药用次生代谢产物的生成与POD活性大小及同工酶谱带数的消长关系，为探索胡桃楸药源不同生长发育期的特征提供相应的检测生化指标。
1 试验材料
供试材料胡桃楸取自黑龙江省佳木斯市四丰山生长结实较好的成片山核桃林，于2012年5～11月，每月中旬采集胡桃楸成年树种的大致相同部位的茎皮，冰盒保存，尽快带回实验室备用。
2 试验方法
2.1 样品制备
将胡桃楸茎皮用清水洗净，蒸馏水漂洗，滤纸吸干后称重，每克鲜重加4mL提取液（pH7.2的蔗糖—磷酸缓冲液），冰浴下研磨呈匀浆状，4层纱布过滤，将滤液3800r/min离心15min，上清液（样品）置于冰箱（-20℃）备用。
2.2 电泳
采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法，分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度3.5%。4℃恒压（350V）电泳，电极缓冲液为pH值8.3Tris-Gly系统。样品点样量均为15μ1，电泳重复2次。
2.3 染色及迁移率（Rf）的测定
采用醋酸联苯胺法染POD，待酶带显现清晰后，用流水漂洗后置蒸馏水中保存，Rf测定按照张相歧的方法见参考文献。
2.4 凝胶板的保存
用10%甘油浸泡玻璃纸8h以上，然后在玻璃板上先放1张玻璃纸铺平，其上放凝胶，凝胶上再放1张玻璃纸，排除玻璃纸与凝胶间的气泡，阴干、保存，以备考证。
3 结果与讨论
3.1 结果与分析
根据供试胡桃楸7个样品的电泳图谱，绘制模式图并拍照（见图1）。从电泳图谱可见，5～11月，7个样品共显现18条酶带。依染色深浅区分为特强带、强带、次强带、弱带和痕迹带5个级别。为了分析方便，从负极到正极划分为A、B、C3个区，A区Rf=0～0.50，显现4条酶带A1～A4，Rf分别是A1=0.41、A2=0.43、A3=0.46，A4=0.50；B区Rf=0.51～0.70，共显现10条酶带B1～B10，Rf分别是B1=0.53、B2=0.54、B3=0.58、B4=0.60、B5=0.61、B6=0.64、B7=0.67、B8=0.68、B9=0.69、B10=0.70；C区Rf=0.71～1.0，共显现4条酶带C1～C4，Rf分别是C1=0.72、C2=0.73、C3=0.78、C4=0.81。从酶带显示的数目看，5月显示15条酶带，6月显示16条酶带，7月、9月、10月显示14条酶带，8月显示13条酶带，11月显示11条酶带。可见5～11月胡桃楸各生长时期茎皮中POD酶带数变化不大。5月天气渐暖，胡桃楸开始萌芽，此时期属于休眠转入生长期阶段，因此5月为胡桃楸萌芽期，6月为旺盛生长期，所以酶带数最多，分别为15条和16条，7～10月，酶带数略减少，这4个月中同工酶表达较稳定，10月天气转寒，胡桃楸叶片脱落，此时期属于生长转入休眠期阶段，11月胡桃楸进入休眠期，茎皮的POD同工酶表达的酶带数减少较多，表达11条酶带，且活性较低，几乎均为弱带和痕迹带。
胡桃楸茎皮POD同工酶5～11月均较丰富，活性均较强，有9条酶带始终表达，分别为A1、A2、A3、A4、B2、B5、B6、B7、C3等9条酶带，且都大致表现为5～10月活性较强而稳定，而11月下降较大。B9酶带与上述9条酶带表达特点相似，5～10月均表达，活性较低，为弱带和痕迹带，11月表达停止，酶带消失。同时，在胡桃楸茎皮同工酶表达谱中，有4条酶带的表达具典型特点，即B1、B3、B4、B8等4条酶带。其中B1酶带只5月和10月特异表达；B3、B8酶带7月、8月不表达，而B4酶带只7月、8月特异表达。
3.2 讨论
3.2.1 胡桃楸茎皮部POD同工酶表达丰富，活性强
从试验所得酶谱可见，5～11月，胡桃楸茎皮POD同工酶表达丰富，尤其在生长期内，POD酶活性强，酶带清晰稳定，而休眠期POD酶活性大大下降，表达的POD同工酶种类也有所下降，故同工酶分析适合采用茎皮部。同时看到在茎皮的POD同工酶表达谱中，相当一部分酶（A1、A2、A3、A4、B2、B5、B6、B7、B9、C3）在生长期内始终稳定均衡表达，表达量（活性）变化不大。
3.2.2 胡桃楸茎皮部POD同工酶表达具阶段特异性
试验所取胡桃楸材料，5月为萌芽期（休眠转入生长期阶段），6月、7月、8月、9月为生长期，10月天气转寒，胡桃楸叶片脱落，所以此期为生长转入休眠期阶段，11月为休眠期。纵观各时间段胡桃楸茎皮中POD同工酶，可以看出由休眠转入生长期（5月），需要众多的POD酶参与到旺盛的生理代谢过程中，所以此时期表达的酶种类多，产生15条酶带。从表达谱中还可看到，生长期内，6月表达的酶带数最多（16条），为茎皮的旺盛生长时期。7月、8月、9月、10月略有下降且保持稳定，能一定程度反映代谢水平相对稳定，为茎皮的稳定生长时期。进入休眠期（11月），生理代谢水平跟生长期相比大大下降，所以表达的POD同工酶种类减少，酶活性明显降低。 在胡桃楸茎皮POD同工酶表达谱中，B1酶带只5月和10月特异表达，酶带清晰稳定，活性较强。5月和10月皆为胡桃楸年周期中的过渡阶段，此两个时期都有B1酶带出现，即编码B1酶带的基因在两个过渡阶段均有表达，所以B1酶带可作为胡桃楸生长期与休眠期相互过渡的特征性酶带。推测这种同工酶可能与胡桃楸过渡阶段茎皮所需的有关物质的处理有关。另外，在表达谱中可见，B3、B8酶带在7月、8月均不表达，而此2个月特异表达了B4酶带，活性较强（为强带），所以B4与B3、B8酶带可共同作为生长期中7月、8月的特征性酶带。7月、8月为北方佳木斯市一年中最热的2个月，可能B4同工酶的产生与胡桃楸茎皮的耐高温过程中相关生理代谢活动有关。
同工酶是基因表达的产物，广泛存在于各种生物中，与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系。其中过氧化物酶（Peroxidase， POD）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD），是最常研究具抗氧化作用的两种指示酶，也已广泛应用于植物生长发育各阶段的分析中。酶活性高低、同工酶谱变化的差异，在一定程度上受植物器官、不同发育期和各种生态因子的影响。大量研究表明植物体内次生代谢产物的合成过程也有一些关键酶的重要调节作用。目前，关于胡桃楸茎皮的药用次生代谢产物如黄酮类、蒽醌类等的研究较多，且多数学者的材料均取自秋季茎皮。关于茎皮中次生代谢产物含量的动态变化研究甚少，关于次生代谢产物的合成与起调控作用的同工酶之间的关系尚不清楚，相关研究也很少。从本试验结果可见POD酶可以反映胡桃楸不同生长时期的代谢活动。试验结果为胡桃楸的引种栽培提供参考，为核桃楸药源的合理、高效开发提供生化参考依据。
参考文献
[1] 黄余龙，饶燕，黄山，等.核桃楸树皮提取物对志贺氏菌抑菌效果研究[J].现代生物医学进展，2011，11（10）：1921-1923.
[2] 赵玉佳，雷涛，张春军，等.核桃楸皮化学成分研究进展[J].牡丹江医学院学报，2010，31（4）：61-62.
[3] 张咏莉，詹苗，毛建文，等.山核桃树皮中黄酮类化合物的提取及含量测定[J].新中医，2009，41（7）：104-106.
[4] 林瑞新，房学东，曹宏，等.核桃楸皮提取物对胃癌细胞增殖的影响[J].中国生物制品学杂志，2010，23（3）：294-296.
[5] 崔哲.胡桃楸的研究进展[J].现代医药卫生，2008，24（20）：3061-3062.
作者简介：张丽敏（1972-），女，汉族，黑龙江省佳木斯市人，硕士，副教授，主要从事遗传学及植物同工酶的研究。
关键词：胡桃楸茎皮；POD；同工酶
中图分类号：R284.1 文献标识码：A
胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim）又名山核桃、核桃楸、胡桃、小核桃等，为胡桃科胡桃属落叶乔木。为珍贵用材，也是著名的药用植物。目前，有关胡桃楸茎皮药效及药用成分研究的报道较多，且偏重于其抗性研究，而对胡桃楸POD同工酶的研究较少。本试验通过对胡桃楸茎皮的POD同工酶进行生长期比较和分析，旨在揭示胡桃楸同工酶谱带的变化规律，为更好地了解山核桃生长期特点，探讨山核桃生理代谢、发育特点与同工酶谱带的关系，为促进胡桃楸食药用开发利用提供生化水平参考。并试图为进一步探讨药用次生代谢产物的生成与POD活性大小及同工酶谱带数的消长关系，为探索胡桃楸药源不同生长发育期的特征提供相应的检测生化指标。
1 试验材料
供试材料胡桃楸取自黑龙江省佳木斯市四丰山生长结实较好的成片山核桃林，于2012年5～11月，每月中旬采集胡桃楸成年树种的大致相同部位的茎皮，冰盒保存，尽快带回实验室备用。
2 试验方法
2.1 样品制备
将胡桃楸茎皮用清水洗净，蒸馏水漂洗，滤纸吸干后称重，每克鲜重加4mL提取液（pH7.2的蔗糖—磷酸缓冲液），冰浴下研磨呈匀浆状，4层纱布过滤，将滤液3800r/min离心15min，上清液（样品）置于冰箱（-20℃）备用。
2.2 电泳
采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法，分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度3.5%。4℃恒压（350V）电泳，电极缓冲液为pH值8.3Tris-Gly系统。样品点样量均为15μ1，电泳重复2次。
2.3 染色及迁移率（Rf）的测定
采用醋酸联苯胺法染POD，待酶带显现清晰后，用流水漂洗后置蒸馏水中保存，Rf测定按照张相歧的方法见参考文献。
2.4 凝胶板的保存
用10%甘油浸泡玻璃纸8h以上，然后在玻璃板上先放1张玻璃纸铺平，其上放凝胶，凝胶上再放1张玻璃纸，排除玻璃纸与凝胶间的气泡，阴干、保存，以备考证。
3 结果与讨论
3.1 结果与分析
根据供试胡桃楸7个样品的电泳图谱，绘制模式图并拍照（见图1）。从电泳图谱可见，5～11月，7个样品共显现18条酶带。依染色深浅区分为特强带、强带、次强带、弱带和痕迹带5个级别。为了分析方便，从负极到正极划分为A、B、C3个区，A区Rf=0～0.50，显现4条酶带A1～A4，Rf分别是A1=0.41、A2=0.43、A3=0.46，A4=0.50；B区Rf=0.51～0.70，共显现10条酶带B1～B10，Rf分别是B1=0.53、B2=0.54、B3=0.58、B4=0.60、B5=0.61、B6=0.64、B7=0.67、B8=0.68、B9=0.69、B10=0.70；C区Rf=0.71～1.0，共显现4条酶带C1～C4，Rf分别是C1=0.72、C2=0.73、C3=0.78、C4=0.81。从酶带显示的数目看，5月显示15条酶带，6月显示16条酶带，7月、9月、10月显示14条酶带，8月显示13条酶带，11月显示11条酶带。可见5～11月胡桃楸各生长时期茎皮中POD酶带数变化不大。5月天气渐暖，胡桃楸开始萌芽，此时期属于休眠转入生长期阶段，因此5月为胡桃楸萌芽期，6月为旺盛生长期，所以酶带数最多，分别为15条和16条，7～10月，酶带数略减少，这4个月中同工酶表达较稳定，10月天气转寒，胡桃楸叶片脱落，此时期属于生长转入休眠期阶段，11月胡桃楸进入休眠期，茎皮的POD同工酶表达的酶带数减少较多，表达11条酶带，且活性较低，几乎均为弱带和痕迹带。
胡桃楸茎皮POD同工酶5～11月均较丰富，活性均较强，有9条酶带始终表达，分别为A1、A2、A3、A4、B2、B5、B6、B7、C3等9条酶带，且都大致表现为5～10月活性较强而稳定，而11月下降较大。B9酶带与上述9条酶带表达特点相似，5～10月均表达，活性较低，为弱带和痕迹带，11月表达停止，酶带消失。同时，在胡桃楸茎皮同工酶表达谱中，有4条酶带的表达具典型特点，即B1、B3、B4、B8等4条酶带。其中B1酶带只5月和10月特异表达；B3、B8酶带7月、8月不表达，而B4酶带只7月、8月特异表达。
3.2 讨论
3.2.1 胡桃楸茎皮部POD同工酶表达丰富，活性强
从试验所得酶谱可见，5～11月，胡桃楸茎皮POD同工酶表达丰富，尤其在生长期内，POD酶活性强，酶带清晰稳定，而休眠期POD酶活性大大下降，表达的POD同工酶种类也有所下降，故同工酶分析适合采用茎皮部。同时看到在茎皮的POD同工酶表达谱中，相当一部分酶（A1、A2、A3、A4、B2、B5、B6、B7、B9、C3）在生长期内始终稳定均衡表达，表达量（活性）变化不大。
3.2.2 胡桃楸茎皮部POD同工酶表达具阶段特异性
试验所取胡桃楸材料，5月为萌芽期（休眠转入生长期阶段），6月、7月、8月、9月为生长期，10月天气转寒，胡桃楸叶片脱落，所以此期为生长转入休眠期阶段，11月为休眠期。纵观各时间段胡桃楸茎皮中POD同工酶，可以看出由休眠转入生长期（5月），需要众多的POD酶参与到旺盛的生理代谢过程中，所以此时期表达的酶种类多，产生15条酶带。从表达谱中还可看到，生长期内，6月表达的酶带数最多（16条），为茎皮的旺盛生长时期。7月、8月、9月、10月略有下降且保持稳定，能一定程度反映代谢水平相对稳定，为茎皮的稳定生长时期。进入休眠期（11月），生理代谢水平跟生长期相比大大下降，所以表达的POD同工酶种类减少，酶活性明显降低。 在胡桃楸茎皮POD同工酶表达谱中，B1酶带只5月和10月特异表达，酶带清晰稳定，活性较强。5月和10月皆为胡桃楸年周期中的过渡阶段，此两个时期都有B1酶带出现，即编码B1酶带的基因在两个过渡阶段均有表达，所以B1酶带可作为胡桃楸生长期与休眠期相互过渡的特征性酶带。推测这种同工酶可能与胡桃楸过渡阶段茎皮所需的有关物质的处理有关。另外，在表达谱中可见，B3、B8酶带在7月、8月均不表达，而此2个月特异表达了B4酶带，活性较强（为强带），所以B4与B3、B8酶带可共同作为生长期中7月、8月的特征性酶带。7月、8月为北方佳木斯市一年中最热的2个月，可能B4同工酶的产生与胡桃楸茎皮的耐高温过程中相关生理代谢活动有关。
同工酶是基因表达的产物，广泛存在于各种生物中，与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系。其中过氧化物酶（Peroxidase， POD）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD），是最常研究具抗氧化作用的两种指示酶，也已广泛应用于植物生长发育各阶段的分析中。酶活性高低、同工酶谱变化的差异，在一定程度上受植物器官、不同发育期和各种生态因子的影响。大量研究表明植物体内次生代谢产物的合成过程也有一些关键酶的重要调节作用。目前，关于胡桃楸茎皮的药用次生代谢产物如黄酮类、蒽醌类等的研究较多，且多数学者的材料均取自秋季茎皮。关于茎皮中次生代谢产物含量的动态变化研究甚少，关于次生代谢产物的合成与起调控作用的同工酶之间的关系尚不清楚，相关研究也很少。从本试验结果可见POD酶可以反映胡桃楸不同生长时期的代谢活动。试验结果为胡桃楸的引种栽培提供参考，为核桃楸药源的合理、高效开发提供生化参考依据。
参考文献
[1] 黄余龙，饶燕，黄山，等.核桃楸树皮提取物对志贺氏菌抑菌效果研究[J].现代生物医学进展，2011，11（10）：1921-1923.
[2] 赵玉佳，雷涛，张春军，等.核桃楸皮化学成分研究进展[J].牡丹江医学院学报，2010，31（4）：61-62.
[3] 张咏莉，詹苗，毛建文，等.山核桃树皮中黄酮类化合物的提取及含量测定[J].新中医，2009，41（7）：104-106.
[4] 林瑞新，房学东，曹宏，等.核桃楸皮提取物对胃癌细胞增殖的影响[J].中国生物制品学杂志，2010，23（3）：294-296.
[5] 崔哲.胡桃楸的研究进展[J].现代医药卫生，2008，24（20）：3061-3062.
作者简介：张丽敏（1972-），女，汉族，黑龙江省佳木斯市人，硕士，副教授，主要从事遗传学及植物同工酶的研究。