酶法制备的骨胶原蛋白肽为混合肽，通常具有多种潜在的生物活性，但目前缺乏基于促成骨细胞增殖活性的靶向性研究。本实验以酶法制备的牦牛骨胶原蛋白肽为原料，采用高效液相色谱法与纳米液相色谱-串联质谱法分别测定混合肽的分子质量与序列构成，基于与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的CDOCKER半柔性对接，靶向筛选具有潜在促成骨细胞增殖活性的骨胶原蛋白肽，并进行体外细胞增殖培养验证。结果表明，共鉴定得到78条牦牛骨胶原蛋白肽，主要以低分子质量肽段为主（小于3 000 Da的组分占91.8%），通过与EGFR对接发现，多肽GPAGPQGPRGDKGETGEQ（GP-18,1 736.815 Da）、TPEVDDEALEKFDK（TP-14,1 634.775 Da）、GPAGPQGPRGDKGETGE（GP-17,1 608.757 Da）、GKSGDRGETGPAGPAGPIGPV（GK-21,1 875.951 Da）和GKSGDRGETGPAGPAGPIGPVG（GK-22,1 932.973 Da）具有潜在促成骨细胞增殖活性。小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞培养实验结果表明，3.0 mg/mL GK-22促成骨细胞相对增殖率达106%，显著高于空白组（P<0.05）。本研究可为促成骨细胞增殖活性肽的靶向筛选和工业化制备提供理论参考。