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摘要：目的：优选痹祺胶囊牛膝的最佳水提取工艺。
方法：采用正交试验设计法，以β-蜕皮甾酮含量为指标，确定加水量、提取次数、提取时间3个提取参数。
结果：确定痹祺胶囊牛膝的最佳提取工艺为加11倍量水，提取3次，每次1.5小时。
结论：痹祺胶囊牛膝提取工艺稳定，适合大生产需求。
关键词：痹祺胶囊 β-蜕皮甾酮 提取工艺 正交试验
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.07.593
【中图分类号】R9【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2014)07-0365-02
痹祺胶囊是治疗风湿类常见病和关节炎等慢性病的代表药方，临床效果确切，由党参、牛膝、马钱子（调制粉）等10味药组成，具有益气养血、祛风除湿、活血止痛之功效。临床上用于气血不足、风湿瘀阻、肌肉关节酸痛、关节肿大、僵硬变形或肌肉萎缩、气短乏力、风湿、类风湿性关节炎、腰肌劳损、软组织损伤的治疗，效果显著。由于痹祺胶囊复方组成多达十味中药，成分复杂，口服一次4粒，患者吞咽困难，易导致治疗依从性下降。本文采用正交试验法对其组方中牛膝进行提取工艺研究，确定了最佳提取工艺。
1 仪器与试剂
Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD检测器，ChemStation工作站；β-蜕皮甾酮对照品（中国食品药品检定研究院，111638-201304）；乙腈为色谱纯（Merck公司），其他试剂均为分析纯（天津市康科德科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计：采用L9(34)正交试验法对提取工艺进行考察优选。选用对提取效果影响较大的3个主要因素：加水量（A）、提取次数（B）、提取时间（C），每个因素均取3个水平进行优选，以β-蜕皮甾酮的含量(μg/100g药材)为考查指标，优化提取工艺，因素水平见表1。
表1 因素水平表
水平
A（溶剂量/倍）
B（提取次数/次）
C（提取时间/h）
1
9
1
1
2
10
2
1.5
3
11
3
2
2.2 β-蜕皮甾酮含量的测定。
2.2.1 色谱条件：ZORBAX Eclipse C18色谱柱，150mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1）；流速为1mL/min；检测波长250nm；柱温40℃。此色谱条件下，理论板数按β-蜕皮甾酮峰计算，应不低于4000。
2.2.2 对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1）的溶液制成每1mL含β-蜕皮甾酮100μg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备：按正交表设计，分别进行提取，依次测定提取液体积，取提取液适量，过0.45μm微孔有机滤膜，取续滤液，即得。
2.2.4 标准曲线的绘制：取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1）混合溶液制成每1ml含500μg的对照品溶液，分别精密吸取该溶液1、2、3、5ml置10ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，分别吸取10μL注入液相色谱仪，依2.2.1项下色谱条件进行测定，计算，以峰面积对浓度回归，得回归方程y =7.4408x +11.117，R2 = 0.9995，结果表明，β-蜕皮甾酮在50~500μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验：精密吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液，依2.2.1项下色谱条件连续进样6次进行测定，每次10μL，计算β-蜕皮甾酮峰面积的RSD为1.27%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验：取2.2.3项下A1B1C1供试品溶液，依2.2.1项下色谱条件每隔1h进样1次，每次10μL，共6次，计算β-蜕皮甾酮峰面积的RSD为0.41%，表明供试品溶液在6小时内稳定。
2.3 痹祺胶囊牛膝水提取工艺确定：正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 水提取工艺正交试验安排及结果
试验号
A
B
C
D
β-蜕皮甾酮含量（μg/100g药材）
1
1
1
1
1
3.779
2
1
2
2
2
5.114
3
1
3
3
3
5.720
4
2
1
2
3
4.458
5
2
2
3
1
5.300
6
2
3
1
2
5.899
7
3
1
3
2
4.377
8
3
2
1
3
5.517
9
3
3
2
1
6.216
K114.61312.61415.19515.295
K215.65715.93015.78815.390
K316.11017.83615.39715.695
k14.8714.2055.0655.098
k25.2195.3105.2635.130
k35.3705.9455.1325.232
R0.4991.7400.1980.134
表3 试验结果方差分析表
因素
偏差平方和
自由度
F比
F临界值
显著性
A（溶剂量/倍）
0.393
2
13.552
19.000
B（提取次数/次）
4.654
2
160.483
19.000
*
C（提取时间/h）
0.061
2
2.103
19.000
误差E
0.03
2
F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。
由以上方差分析可知，影响因素大小顺序为：B＞A＞C，且A3B3C2最佳，加11倍量水，提取3次，每次1.5小时。
3 讨论
牛膝为苋科植物牛膝的干燥根。其味甘、苦、酸，性平，入肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，活血通经，引血(火)下行，利尿通淋的功效[1]。高晓燕等[2]证明蜕皮甾酮化合物有促成骨样细胞增殖活性。牛膝中总甾酮含量约为0.2%，其主要的活性成分蜕皮甾酮含量为0.04%~0.2%[3]。本文中对痹祺胶囊组方中牛膝进行了水提取工艺的研究，其他组方成分的提取方法还需进一步探讨，提取物的药理作用也需要实验进行进一步的验证。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：830
[2] 高晓燕，王大为，李发美.牛膝中脱皮甾酮的含量测定及促成骨样细胞增殖活性[J].药学学报，2000，35(11)：868-870
[3] 李金亭，滕红梅，胡正海.牛膝营养器官中蜕皮甾酮的积累动态研究.中草药，2007，38(10)：1750
方法：采用正交试验设计法，以β-蜕皮甾酮含量为指标，确定加水量、提取次数、提取时间3个提取参数。
结果：确定痹祺胶囊牛膝的最佳提取工艺为加11倍量水，提取3次，每次1.5小时。
结论：痹祺胶囊牛膝提取工艺稳定，适合大生产需求。
关键词：痹祺胶囊 β-蜕皮甾酮 提取工艺 正交试验
Doi:10.3969/j.issn.1671-8801.2014.07.593
【中图分类号】R9【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801(2014)07-0365-02
痹祺胶囊是治疗风湿类常见病和关节炎等慢性病的代表药方，临床效果确切，由党参、牛膝、马钱子（调制粉）等10味药组成，具有益气养血、祛风除湿、活血止痛之功效。临床上用于气血不足、风湿瘀阻、肌肉关节酸痛、关节肿大、僵硬变形或肌肉萎缩、气短乏力、风湿、类风湿性关节炎、腰肌劳损、软组织损伤的治疗，效果显著。由于痹祺胶囊复方组成多达十味中药，成分复杂，口服一次4粒，患者吞咽困难，易导致治疗依从性下降。本文采用正交试验法对其组方中牛膝进行提取工艺研究，确定了最佳提取工艺。
1 仪器与试剂
Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD检测器，ChemStation工作站；β-蜕皮甾酮对照品（中国食品药品检定研究院，111638-201304）；乙腈为色谱纯（Merck公司），其他试剂均为分析纯（天津市康科德科技有限公司）。
2 方法与结果
2.1 正交试验设计：采用L9(34)正交试验法对提取工艺进行考察优选。选用对提取效果影响较大的3个主要因素：加水量（A）、提取次数（B）、提取时间（C），每个因素均取3个水平进行优选，以β-蜕皮甾酮的含量(μg/100g药材)为考查指标，优化提取工艺，因素水平见表1。
表1 因素水平表
水平
A（溶剂量/倍）
B（提取次数/次）
C（提取时间/h）
1
9
1
1
2
10
2
1.5
3
11
3
2
2.2 β-蜕皮甾酮含量的测定。
2.2.1 色谱条件：ZORBAX Eclipse C18色谱柱，150mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1）；流速为1mL/min；检测波长250nm；柱温40℃。此色谱条件下，理论板数按β-蜕皮甾酮峰计算，应不低于4000。
2.2.2 对照品溶液的制备：取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1）的溶液制成每1mL含β-蜕皮甾酮100μg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备：按正交表设计，分别进行提取，依次测定提取液体积，取提取液适量，过0.45μm微孔有机滤膜，取续滤液，即得。
2.2.4 标准曲线的绘制：取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1）混合溶液制成每1ml含500μg的对照品溶液，分别精密吸取该溶液1、2、3、5ml置10ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，分别吸取10μL注入液相色谱仪，依2.2.1项下色谱条件进行测定，计算，以峰面积对浓度回归，得回归方程y =7.4408x +11.117，R2 = 0.9995，结果表明，β-蜕皮甾酮在50~500μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验：精密吸取β-蜕皮甾酮对照品溶液，依2.2.1项下色谱条件连续进样6次进行测定，每次10μL，计算β-蜕皮甾酮峰面积的RSD为1.27%，表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验：取2.2.3项下A1B1C1供试品溶液，依2.2.1项下色谱条件每隔1h进样1次，每次10μL，共6次，计算β-蜕皮甾酮峰面积的RSD为0.41%，表明供试品溶液在6小时内稳定。
2.3 痹祺胶囊牛膝水提取工艺确定：正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 水提取工艺正交试验安排及结果
试验号
A
B
C
D
β-蜕皮甾酮含量（μg/100g药材）
1
1
1
1
1
3.779
2
1
2
2
2
5.114
3
1
3
3
3
5.720
4
2
1
2
3
4.458
5
2
2
3
1
5.300
6
2
3
1
2
5.899
7
3
1
3
2
4.377
8
3
2
1
3
5.517
9
3
3
2
1
6.216
K114.61312.61415.19515.295
K215.65715.93015.78815.390
K316.11017.83615.39715.695
k14.8714.2055.0655.098
k25.2195.3105.2635.130
k35.3705.9455.1325.232
R0.4991.7400.1980.134
表3 试验结果方差分析表
因素
偏差平方和
自由度
F比
F临界值
显著性
A（溶剂量/倍）
0.393
2
13.552
19.000
B（提取次数/次）
4.654
2
160.483
19.000
*
C（提取时间/h）
0.061
2
2.103
19.000
误差E
0.03
2
F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。
由以上方差分析可知，影响因素大小顺序为：B＞A＞C，且A3B3C2最佳，加11倍量水，提取3次，每次1.5小时。
3 讨论
牛膝为苋科植物牛膝的干燥根。其味甘、苦、酸，性平，入肝、肾经，具有补肝肾，强筋骨，活血通经，引血(火)下行，利尿通淋的功效[1]。高晓燕等[2]证明蜕皮甾酮化合物有促成骨样细胞增殖活性。牛膝中总甾酮含量约为0.2%，其主要的活性成分蜕皮甾酮含量为0.04%~0.2%[3]。本文中对痹祺胶囊组方中牛膝进行了水提取工艺的研究，其他组方成分的提取方法还需进一步探讨，提取物的药理作用也需要实验进行进一步的验证。
参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：830
[2] 高晓燕，王大为，李发美.牛膝中脱皮甾酮的含量测定及促成骨样细胞增殖活性[J].药学学报，2000，35(11)：868-870
[3] 李金亭，滕红梅，胡正海.牛膝营养器官中蜕皮甾酮的积累动态研究.中草药，2007，38(10)：1750