【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征是世界规模化猪场的主要疫病之一,主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起.本研究旨在构建PRRSV高致病性毒株HN07-1反向操作系统.通过将基因组进行分段克隆和测序的方法获得HN07-1毒株全长基因组序列.运用反向遗传学技术将全基因组分段克隆至载体上,构建含有全长HN07-1毒株cDNA的感染性克隆pcDNA3.2-rHN07-1,并以此为骨架,构建在PRRSV基因组ORF1b
【机 构】
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河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,郑州450002;河南农业大学,郑州450002
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猪繁殖与呼吸综合征是世界规模化猪场的主要疫病之一,主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起.本研究旨在构建PRRSV高致病性毒株HN07-1反向操作系统.通过将基因组进行分段克隆和测序的方法获得HN07-1毒株全长基因组序列.运用反向遗传学技术将全基因组分段克隆至载体上,构建含有全长HN07-1毒株cDNA的感染性克隆pcDNA3.2-rHN07-1,并以此为骨架,构建在PRRSV基因组ORF1b和ORF2a间插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的重组克隆pcDNA3.2-rHN07-1-EGFP;将构建的质粒转染Marc-145细胞拯救病毒.采用免疫荧光实验(immune fluorescence assay,IFA)和Western blot进行表达鉴定并对重组病毒进行滴度测定与分析.结果表明,PRRSV毒株HN07-1基因组全长15345 nt,转染Marc-145细胞盲传一代后培养48 h出现典型的细胞病变效应,IFA和Western blot检测结果表明,拯救病毒与亲本毒株HN07-1一致,都能检测到PRRSV N蛋白表达.并且拯救病毒与亲本毒株具有相似的生长动力特性.综上所述,本研究成功构建了HN07-1感染性克隆,可用于反向遗传操作,为PRRSV致病机制研究及疫苗研发提供了参考.
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