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摘要SSR分子标记是目前应用较广泛的分子标记技术之一。对SSR标记的原理、特点和开发方法进行了总结，综述了SSR分子标记技术在植物DNA指纹图谱构建、遗传多样性分析、种子纯度及真伪鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等方面的应用现状，并对目前SSR标记应用中出现的问题进行了讨论，以期为下一步开展西藏野生观赏植物资源的分子研究奠定基础。
关键词SSR分子标记；开发方法；遗传多样性；DNA指纹图谱
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）36-0123-04
AbstractSSR molecular markers are one of the most widely used molecular marker technologies.This paper summarized the principles，characteristics and development methods of SSR markers，and summarized the SSR technique in plant DNA fingerprinting，genetic diversity analysis，seed purity and authenticity identification，genetic map construction，molecular marker assisted breeding and other aspects of the application of the status quo，and the current application of SSR markers were discussed in order to carry out the next step in Tibet wild ornamental plant resources to lay the foundation for molecular research.
Key wordsSSR molecular markers；Development method；Genetic diversity；DNA fingerprints
SSR简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也称为微卫星DNA（Microsatellite DNA），由1～6个碱基为重复单位，形成长达数十个核苷酸的串联重复序列，如（AT）n、（AC）n、（GA）n、（AAG）n、（AAT）n、（CATG）n等。微卫星序列广泛分布于植物基因组中，且SSR序列在不同物种中长度、重复单位次数、突变情况有所不同，在染色体上的分布也存在差异，等位基因的多样性也由此形成。基于SSR标记技术的共显性、分布广、多态性高、低成本、高效率等优点，SSR标记已广泛应用于动植物群体分析[1]、构建DNA指纹图谱[2-5]、品种鉴定以及辅助育种等多个方面[4-9]。西藏拥有种类多样、形态各异的野生观赏植物资源，长期以来，西藏野生观赏植物资源研究主要集中于表现型差异比较、培育技术研究方面，缺乏基于分子层面的深入研究[10]。为进一步探明西藏野生观赏植物多样性形成的分子机理，该研究对SSR标记的方法、应用进行了总结分析，并对相关问题进行了讨论，以期为开展西藏野生观赏植物资源的分子研究奠定基础。
1SSR标记的原理及特点
SSR重复单位的大小、序列和拷贝数呈多态性，但是基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列保守性较强，因此根据保守侧翼序列可设计特异引物，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术扩增出SSR DNA序列，再利用不同的电泳方法分离片段，获得长度多态性，即为SSR分子标记。
SSR标记具有较多优点[11-13]：多态性高，均匀分布于整个基因组；共显性遗传，可有效鉴别杂合个体；带型简单、易识别、可自动化分析；稳定性、重复性好；操作简便，试验周期短；成本较低，对DNA 质量要求低。因此SSR 标记在DNA指纹图谱构建、品种鉴定、遗传分析、分子辅助育种等方面得到广泛应用。
2SSR分子标记的开发方法
2.1构建文库筛选SSR标记传统的开发SSR标记方法是构建基因组文库筛选SSR标记，也是公认的经典方法。这类方法要求提取高质量的基因组DNA，对于基因组很大的物种，全基因组测序较为困难，可以利用部分基因组序列开发SSR位点[14]。目前也有利用转录组文库筛选SSR位点的报道，Luro等[15]基于转录组测序技术开发了克莱门柚（Citrus clementina）的 SSR 标记，发现研究中的41个标记通用性都较好，可以用于柑橘属内的其他物种中，既能检测柑橘内的遗传多样性，还可进行种间分类研究。鄢秀芹等[16]利用MISA软件筛选刺梨（Rosa roxburghii）转录组测序获得的106 590条Unigene，共检测出21 711个SSR位点，分布于18 155条Unigene中，出现频率为20.37%，平均分布距离为1.68 kb。但是传统的文库法需要对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大，费用高，效率低，因此在实际应用中又产生了富集技术。
2.2富集技术筛选SSR标记为提高SSR开发效率、降低成本，提高阳性克隆率，人们先用SSR探针杂交技术来富集基因DNA片段，然后建立基因组文库。季丽静[17]以芍药（Paeonia lactiflora）品种Charlie’s White为材料，利用磁珠富集法构建微卫星富集文库，再经过阳性克隆、筛选、测序，获取了82个SSR位点，设计引物50对。李亚慧[18]利用磁珠富集法开发菊花（Chrysanthemum morifolium）微卫星位点，最终根据88个完整的可用于引物设计的微卫星序列设计了142对引物。刘路贤[19]利用生物素-磁珠吸附微卫星富集法开发了菊花SSR标记，用含5个群体的44个菊花品种对8对引物进行检测，其中6对具有多态性，2对没有多态性。虽然这种方法提高了筛选SSR的效率，缩短了试验周期，但是操作過程相对繁琐且需要构建和筛选基因组文库。 2.3基于 PCR 技术开发 SSR 标记
Cifarelli等[20]利用随机扩增多态性DNA（Random Amplified polymoerphic DNA，RAPD）策略将SSR与随机扩增产物进行杂交，在甜菜（Beta vulgaris）、向日葵（Helianthus annuus）、橄榄（Canarium album）等植物中分离出SSR标记，但是阳性克隆率较低。继而Lunt等[21]在Cifarelli等的研究基础上，提出了SSR序列PCR分离技术——PIMA（PCRbased isolation of microsatellites arrays，PIMA），实现快速分离基因组中的SSR及其侧翼序列。后来，Fisher 等[22]为增加获得SSR标记的概率，提出了利用 5' 锚定PCR法开发SSR标记，该方法对于缺乏基因组信息的物种来说，是一种开发SSR标记简便有效的方法。李明芳等[23]利用5' 锚定PCR技术在荔枝（Litchi chinensis）无核品种A4号试验材料中克隆出100个SSR序列，阳性克隆率达93%，Ai等[24]用此方法从欧洲甜樱桃（Cerasus avium）中得到24对SSR引物，且多态性较好。
2.4利用数据库信息开发SSR标记
近年生物信息技术发展迅速，人们可直接利用公共数据库获取大量信息，进而开发SSR引物。世界上有三大生物信息数据库，分别是美国国家生物技术信息中心的NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库、欧洲分子生物学实验室建立的EMBL（Europe Molecular Biology Laboratory）数据库以及日本DNA数据库DDBJ（DNA Data Bank of Japan）。为保证数据尽可能完全，上述3个数据库建立了相互交换数据的合作关系，3个数据库均含有丰富资源，通过相应的软件对数据库进行搜索可以获取SSR信息。目前，已有不少植物基本上都可在專门的DNA数据库中查找SSR位点，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、油菜（Brassica rapa var.oleifera）、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）等。李炎林等[25]利用 Trinity 软件对NCBI公共数据库中公布的南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）根、茎和叶的转录数据进行转录组重新拼接，对13 737 528条序列组装得到96 279条Unigene（38 Mb），通过SSR检测程序从96 279条 Unigene 中得到2 160个SSR位点（2.24%），平均发生率为1/18.01 kb，基序长度为14～25 bp。优势重复基序为六核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR位点的38.56%和37.08%。张晗等[26]对从Phytozome数据库中获取的谷子基因组序列进行SSR位点搜索，在21 150.78 kb序列中发现2 872个SSR位点，平均每7.36 kb就有1个SSR，共发现126种重复基元，其中二碱基和三碱基重复类型分别占63.41%和31.86%，设计的74对SSR引物中有64对可以稳定扩增。
近年，生物技术飞速发展，研究者得到的信息越来越多，并且可以将信息上传到公共数据库，也使得数据库信息不断丰富，进而使更多的研究者从中寻找有效信息，节省大量时间和试验成本。总之，生物信息公共数据库的存在实现了全世界生物信息资源的有效整合利用。
3SSR分子标记在植物研究中的应用分析
SSR分子标记技术在植物DNA指纹图谱构建、遗传分析、种子纯度及真伪鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等方面应用广泛。
3.1基于SSR标记构建的植物DNA指纹图谱
DNA 指纹图谱是指品种间具有差异的、能够鉴别不同品种的DNA电泳图谱，个体间特异性及环境稳定性高，且便于系统管理。SSR分子标记是构建 DNA 指纹图谱的首选方法。借助DNA指纹图谱可以进行品种权保护、遗传分析，为育种工作的材料选择提供科学参考，为品种的稳定性、特异性和一致性（Stability，Distinctness，Uniformity，DUS）鉴定提供技术支持，可与DUS测验形态鉴定完美结合[23]。
Duca等[27]使用10个SSR标记对10个向日葵（Helianthm annum）亲代品种进行了遗传多样性分析，发现9个标记具有多态性，利用其中7个条带清晰、多态性高的标记建立了所选品种的SSR指纹图谱。季丽静[17]对61个芍药品种构建了指纹图谱，可以很好地反映出各品种的特异性，其中出现1～4条带的情况，这与所用的芍药新品种倍型丰富有关，对倍性确定有一定的参考价值。范建光等[28]构建了788份西瓜品种的指纹图谱库，并形成自动化、实用化、准确化的数据库。
玉米品种DNA指纹检测平台是目前我国作物中最成熟的检测技术平台，在玉米品种管理中应用最为广泛，也使得管理工作有了很大程度的提升。我国正在进行的植物DNA指纹图谱构建研究不少，但在试验技术的稳定性、方法的一致性、数据标准化、规范化采集以及数据库存储等方面还存在不足。为满足植物品种鉴定、保护、分类等工作，加快构建DNA指纹数据库检测平台、软件开发、数据化、自动化的研发成为亟待解决的问题[29-31]。
3.2遗传多样性分析
在生物的长期演化过程中，基因的多样性是物种分化和生命进化的基础，产生多样性的根本原因是遗传物质的改变。随着生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展，检测遗传多样性的方法在不断提高和完善，目前SSR分子标记是进行遗传多样性分析最有效的方法之一。 黄丹娟[32]利用128个SSR 标记分析了我国茶树（Camellia sinensis）优良品种的遗传多样性水平，在254个茶树品种中共检测到629个等位变异，可将这些材料成功分类。匡猛等[33]对我国棉花（Gossypium cvs.）主栽品种进行了遗传相似性分析，表明了杂交种间的遗传差异大于常规种间的遗传差异，源于同一棉区的品种在一定程度上亲缘关系相近。段艳凤等[34]利用SSR标记构建了我国2000—2007年审定的88个马铃薯（Solanum tuberosum）品种的指纹图谱，同时进行的遗传多样性分析结果与供试材料系谱来源相符，并且同一栽培区域育成的品种在不同程度上聚在一类。范建光[28]选取788份西瓜种质材料进行了遗传多样性分析，在遗传距离为0.477处将所有材料分为5类。总之，利用SSR标记进行遗传距离、聚类分析，可将所研究的材料划分为不同的类群，为品种演化、类群分析提供参考；根据类群划分，选择育种材料时就可从大量的资源中快速选择，加快育种进程。
3.3种子纯度及真伪鉴定
我国是农业种植大国，种子的真实性和纯度是影响产量、质量最重要的因素，也是種子质量检验和新品种鉴定最重要的指标，直接影响种子企业的生存与否。因此，当前种子生产经营企业及行业主管部门需要一套快速、准确、可靠的检测技术，目前的检测方法主要有形态、生化和 DNA 分子标记3个层次。传统的形态鉴定法耗时耗力，易受外界因素影响，如气候条件变化、人为主观判断的影响；生化法稳定性差，且标记数量有限，不能满足生产和经营发展的要求；利用分子标记方法，鉴定高效、准确、数量多，且不易受环境、生长周期、季节影响，成为种子纯度及真伪鉴定技术必然的发展趋势[35]。 SSR 标记因多态性丰富、稳定性好、易操作等突出优点被广泛用于指纹图谱构建，进而进行的种子纯度及真伪鉴定具有可靠性。
王凤格等[31]对玉米（Zea mays）审定品种杂合率水平进行分析，平均品种杂合率达64%，主要集中在50%～80%（占89%），表明对大部分玉米审定品种而言，40对核心引物中均能筛选到20～30个双亲互补型引物，这对利用指纹库筛选玉米审定品种的纯度鉴定引物具有重要价值，利用杂交种指纹图谱及其互补带型，即可简便、准确鉴别出玉米杂交种的纯度及真伪[29]。石星星等[35]利用SSR标记对甘蓝杂交种进行真实性及纯度鉴定，结果与形态鉴定结果吻合，2种鉴定方法存在显著相关。
3.4遗传图谱构建及QTL定位
遗传图谱即遗传连锁图谱，是基因组研究中的一个重要组成部分。利用分子标记技术进行遗传图谱构建和数量性状位点（Quantitative Trait Locus，QTL）定位，找到与目标性状紧密连锁或者共分离的标记。近几年QTL定位应用广泛，在人类基因上与疾病有关的基因定位甚多，植物QTL研究主要集中在模式植物抗逆性基因的定位，借助标记辅助选择育种材料可以极大地缩短育种周期、提高育种效率[36]。目前已经有花生（Arachis hypogaea）、油菜、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）、大白菜（Brassica pekinensis）、大豆、玉米、棉花、茶树、梨（Pyrus cvs.）、橡胶树（Hevea brasiliensis）、柴胡（Bupleurum chinense）等基于SSR标记构建的遗传图谱。马建强[36] 以茶树变种间杂交构建的F1分离群体，采用SSR标记技术和简化基因组测序技术（Genotypingbysequencing，GBS），结合拟测交策略分别构建了双亲遗传图谱和双亲整合图谱，并对控制茶树新梢咖啡碱和可可碱含量以及芽叶形态等性状的QTL进行了定位分析。Moretzsohn等[37]利用SSR构建了花生（Arachis duranensis × stenosperma）遗传图谱，此后，洪彦彬等[38]基于 SSR 标记构建的1张花生栽培种分子遗传图谱包含108个标记、涉及20个连锁群，今后花生栽培种上新开发的标记将可直接用于遗传图谱的加密，也可作为花生重要性状的基因定位和QTL分析的框架。
3.5分子标记辅助育种
随着分子标记技术的快速发展，与传统育种技术相比，分子标记辅助选择育种更准确、更高效的特点，可使育种周期大大缩减，且成本降低，因此近年来越来越受到关注。这种生物技术与常规育种技术进行有机结合，将成为孕育植物遗传育种的又一次技术突破。冯常辉等[39]利用长江流域棉花育种重要亲本苏棉12和荆55173（感黄萎病）与抗黄萎病资源Sicala V1和中21373配制2套感病×抗病杂交组合（苏棉12×Sicala V1和荆55173×中21373），在其杂交组合的自交子代群体中挑选与黄萎病抗性相关的9个SSR标记实施分子标记辅助选择育种，通过单标记选择，8个SSR标记的aa与AA 2种基因型个体间的黄萎病校正病情指数差异达到极显著或者显著水平。刘红占[40]利用与抗白粉病基因Pm21共分离的SCAR标记和与抗白粉病基因PmAS846紧密连锁的SSR标记，作为抗病性定向选择分子标记，进行小麦抗病性鉴定和定向改良研究。
4讨论
与其他分子标记相比，SSR标记数量丰富、多态性高、分布于整个基因组、以孟德尔方式遗传、呈共显性的优点，在DNA指纹图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定等方面显示出独特的优越性。
目前分子生物实验室常见的电泳检测方法有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳，前2种电泳方法分辨率低且数据读取不方便，但是其成本低，可以满足要求不高的试验需求，例如在前期大量筛选引物时使用，因此琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳成为普遍的电泳方法。在利用SSR标记构建指纹图谱及品种鉴定时，应用最多的是荧光毛细管电泳法，该方法高效、准确，然而其成本相对较高，主要表现在荧光引物电泳仪器昂贵、分子量内标价格高、荧光引物较普通引物合成成本高。为了降低成本，提高工作效率，科研工作者从试验当中总结经验摸索新方法，形成了高通量多重PCR、核心引物组合法、五色荧光多重电泳技术。赵久然等[29]在玉米DNA指纹研究中，为提高检测效率，通过多重PCR和五色荧光技术对每套引物构建稳定的十重PCR复合扩增体系。在小麦、棉花、水稻等众多植物SSR标记构建指纹图谱及遗传多样性研究中均采用引物组合法进行电泳，不仅使检测效率提高数倍，也使分子量内标成本节省数倍。 一種基于二代测序技术的SSR分型新方法SSRseq，几乎克服了现存所有检测方法的不足，尤其适合对多SSR位点、超高深度的分型，准确度高，并且分辨率达到单碱基水平。因此适合所有二倍体动植物及真核微生物的SSR位点分型。另外，还成功对六倍体植物油茶进行了SSR分型。对于多倍体物种来说，SSRseq可以提供不同等位基因的比例数据，从而提高多倍体物种遗传多样性分析的准确度，获得更加清晰的遗传结构图。虽然SSRseq有诸多优点，但也有一定的局限性：分型位点数和样本量较小时不合适；必须基于已知的染色体倍数才能得到不同等位基因间的相互比例。该技术是否可在其他多倍体、非整倍体植物中应用，在遗传分析、指纹图谱等分析中的实用性、适用性均有待进一步证实。
当前，国际植物新品种保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants ，UPOV）认为SSR标记和SNP技术（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP，单核苷酸多态性）是构建指纹图谱库最适合的2种技术，目前SSR标记技术最为成熟。与SSR相比，SNP标记是第三代分子标记，因其在基因组中密度更高、分布更均匀、更易实现数据整合比较、更高通量、可能与功能基因相关的优势，在分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面发挥了重要作用。近年来以SNP标记为基础构建的Bin图谱、高通量SNP芯片分型以及以SNP标记为基础进行群体进化研究等方面的应用已有大量的报道，SNP被视为最具发展潜力的标记技术。随着测序成本不断降低，SNP数据获得也越来越便利，例如简化基因组测序技术GBS，具有低成本、高通量、不依赖参考基因组、高效率的特点[41-42]，使以前人们望而却步的大样本全基因组基因分型成为了可能，这对进一步探明种质资源的遗传背景、系统演化具有深远意义[43-44]。通过拼接组装GBS获得的短读序列，可获得高密度SNP标记，并在遗传连锁图谱构建[45-47]、遗传群体分析[48]、全基因组关联分析（GWAS）[49-50]、种质鉴定[51]和辅助育种[52]等研究中开始大量应用。总体比较来说，SNP开发成本仍然高于SSR标记。在遗传多样性、品种鉴定等研究中，一般SSR标记即可满足需求，但是对于遗传背景复杂或者样品间相似性大的材料则需要SNP技术进行更准确、深入的研究分析。因此，SNP可作为SSR标记的补充数据库，加以完善。
总而言之，分子标记技术已经在植物分类及品种鉴定、种质资源亲缘关系及进化分析、观赏性状辅助选择、构建指纹图谱等方面得到了应用。西藏观赏植物种类繁多，基于分子标记的物种高效鉴定有助于物种保护和利用等工作的开展，从而更好地指导西藏花卉产业发展实践工作，形成高原生态安全屏障建设总规划条件下，符合西藏特点的生态产业。
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AbstractSSR molecular markers are one of the most widely used molecular marker technologies.This paper summarized the principles，characteristics and development methods of SSR markers，and summarized the SSR technique in plant DNA fingerprinting，genetic diversity analysis，seed purity and authenticity identification，genetic map construction，molecular marker assisted breeding and other aspects of the application of the status quo，and the current application of SSR markers were discussed in order to carry out the next step in Tibet wild ornamental plant resources to lay the foundation for molecular research.
Key wordsSSR molecular markers；Development method；Genetic diversity；DNA fingerprints
SSR简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也称为微卫星DNA（Microsatellite DNA），由1～6个碱基为重复单位，形成长达数十个核苷酸的串联重复序列，如（AT）n、（AC）n、（GA）n、（AAG）n、（AAT）n、（CATG）n等。微卫星序列广泛分布于植物基因组中，且SSR序列在不同物种中长度、重复单位次数、突变情况有所不同，在染色体上的分布也存在差异，等位基因的多样性也由此形成。基于SSR标记技术的共显性、分布广、多态性高、低成本、高效率等优点，SSR标记已广泛应用于动植物群体分析[1]、构建DNA指纹图谱[2-5]、品种鉴定以及辅助育种等多个方面[4-9]。西藏拥有种类多样、形态各异的野生观赏植物资源，长期以来，西藏野生观赏植物资源研究主要集中于表现型差异比较、培育技术研究方面，缺乏基于分子层面的深入研究[10]。为进一步探明西藏野生观赏植物多样性形成的分子机理，该研究对SSR标记的方法、应用进行了总结分析，并对相关问题进行了讨论，以期为开展西藏野生观赏植物资源的分子研究奠定基础。
1SSR标记的原理及特点
SSR重复单位的大小、序列和拷贝数呈多态性，但是基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列保守性较强，因此根据保守侧翼序列可设计特异引物，通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术扩增出SSR DNA序列，再利用不同的电泳方法分离片段，获得长度多态性，即为SSR分子标记。
SSR标记具有较多优点[11-13]：多态性高，均匀分布于整个基因组；共显性遗传，可有效鉴别杂合个体；带型简单、易识别、可自动化分析；稳定性、重复性好；操作简便，试验周期短；成本较低，对DNA 质量要求低。因此SSR 标记在DNA指纹图谱构建、品种鉴定、遗传分析、分子辅助育种等方面得到广泛应用。
2SSR分子标记的开发方法
2.1构建文库筛选SSR标记传统的开发SSR标记方法是构建基因组文库筛选SSR标记，也是公认的经典方法。这类方法要求提取高质量的基因组DNA，对于基因组很大的物种，全基因组测序较为困难，可以利用部分基因组序列开发SSR位点[14]。目前也有利用转录组文库筛选SSR位点的报道，Luro等[15]基于转录组测序技术开发了克莱门柚（Citrus clementina）的 SSR 标记，发现研究中的41个标记通用性都较好，可以用于柑橘属内的其他物种中，既能检测柑橘内的遗传多样性，还可进行种间分类研究。鄢秀芹等[16]利用MISA软件筛选刺梨（Rosa roxburghii）转录组测序获得的106 590条Unigene，共检测出21 711个SSR位点，分布于18 155条Unigene中，出现频率为20.37%，平均分布距离为1.68 kb。但是传统的文库法需要对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大，费用高，效率低，因此在实际应用中又产生了富集技术。
2.2富集技术筛选SSR标记为提高SSR开发效率、降低成本，提高阳性克隆率，人们先用SSR探针杂交技术来富集基因DNA片段，然后建立基因组文库。季丽静[17]以芍药（Paeonia lactiflora）品种Charlie’s White为材料，利用磁珠富集法构建微卫星富集文库，再经过阳性克隆、筛选、测序，获取了82个SSR位点，设计引物50对。李亚慧[18]利用磁珠富集法开发菊花（Chrysanthemum morifolium）微卫星位点，最终根据88个完整的可用于引物设计的微卫星序列设计了142对引物。刘路贤[19]利用生物素-磁珠吸附微卫星富集法开发了菊花SSR标记，用含5个群体的44个菊花品种对8对引物进行检测，其中6对具有多态性，2对没有多态性。虽然这种方法提高了筛选SSR的效率，缩短了试验周期，但是操作過程相对繁琐且需要构建和筛选基因组文库。 2.3基于 PCR 技术开发 SSR 标记
Cifarelli等[20]利用随机扩增多态性DNA（Random Amplified polymoerphic DNA，RAPD）策略将SSR与随机扩增产物进行杂交，在甜菜（Beta vulgaris）、向日葵（Helianthus annuus）、橄榄（Canarium album）等植物中分离出SSR标记，但是阳性克隆率较低。继而Lunt等[21]在Cifarelli等的研究基础上，提出了SSR序列PCR分离技术——PIMA（PCRbased isolation of microsatellites arrays，PIMA），实现快速分离基因组中的SSR及其侧翼序列。后来，Fisher 等[22]为增加获得SSR标记的概率，提出了利用 5' 锚定PCR法开发SSR标记，该方法对于缺乏基因组信息的物种来说，是一种开发SSR标记简便有效的方法。李明芳等[23]利用5' 锚定PCR技术在荔枝（Litchi chinensis）无核品种A4号试验材料中克隆出100个SSR序列，阳性克隆率达93%，Ai等[24]用此方法从欧洲甜樱桃（Cerasus avium）中得到24对SSR引物，且多态性较好。
2.4利用数据库信息开发SSR标记
近年生物信息技术发展迅速，人们可直接利用公共数据库获取大量信息，进而开发SSR引物。世界上有三大生物信息数据库，分别是美国国家生物技术信息中心的NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库、欧洲分子生物学实验室建立的EMBL（Europe Molecular Biology Laboratory）数据库以及日本DNA数据库DDBJ（DNA Data Bank of Japan）。为保证数据尽可能完全，上述3个数据库建立了相互交换数据的合作关系，3个数据库均含有丰富资源，通过相应的软件对数据库进行搜索可以获取SSR信息。目前，已有不少植物基本上都可在專门的DNA数据库中查找SSR位点，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、油菜（Brassica rapa var.oleifera）、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）等。李炎林等[25]利用 Trinity 软件对NCBI公共数据库中公布的南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）根、茎和叶的转录数据进行转录组重新拼接，对13 737 528条序列组装得到96 279条Unigene（38 Mb），通过SSR检测程序从96 279条 Unigene 中得到2 160个SSR位点（2.24%），平均发生率为1/18.01 kb，基序长度为14～25 bp。优势重复基序为六核苷酸和三核苷酸，分别占总SSR位点的38.56%和37.08%。张晗等[26]对从Phytozome数据库中获取的谷子基因组序列进行SSR位点搜索，在21 150.78 kb序列中发现2 872个SSR位点，平均每7.36 kb就有1个SSR，共发现126种重复基元，其中二碱基和三碱基重复类型分别占63.41%和31.86%，设计的74对SSR引物中有64对可以稳定扩增。
近年，生物技术飞速发展，研究者得到的信息越来越多，并且可以将信息上传到公共数据库，也使得数据库信息不断丰富，进而使更多的研究者从中寻找有效信息，节省大量时间和试验成本。总之，生物信息公共数据库的存在实现了全世界生物信息资源的有效整合利用。
3SSR分子标记在植物研究中的应用分析
SSR分子标记技术在植物DNA指纹图谱构建、遗传分析、种子纯度及真伪鉴定、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等方面应用广泛。
3.1基于SSR标记构建的植物DNA指纹图谱
DNA 指纹图谱是指品种间具有差异的、能够鉴别不同品种的DNA电泳图谱，个体间特异性及环境稳定性高，且便于系统管理。SSR分子标记是构建 DNA 指纹图谱的首选方法。借助DNA指纹图谱可以进行品种权保护、遗传分析，为育种工作的材料选择提供科学参考，为品种的稳定性、特异性和一致性（Stability，Distinctness，Uniformity，DUS）鉴定提供技术支持，可与DUS测验形态鉴定完美结合[23]。
Duca等[27]使用10个SSR标记对10个向日葵（Helianthm annum）亲代品种进行了遗传多样性分析，发现9个标记具有多态性，利用其中7个条带清晰、多态性高的标记建立了所选品种的SSR指纹图谱。季丽静[17]对61个芍药品种构建了指纹图谱，可以很好地反映出各品种的特异性，其中出现1～4条带的情况，这与所用的芍药新品种倍型丰富有关，对倍性确定有一定的参考价值。范建光等[28]构建了788份西瓜品种的指纹图谱库，并形成自动化、实用化、准确化的数据库。
玉米品种DNA指纹检测平台是目前我国作物中最成熟的检测技术平台，在玉米品种管理中应用最为广泛，也使得管理工作有了很大程度的提升。我国正在进行的植物DNA指纹图谱构建研究不少，但在试验技术的稳定性、方法的一致性、数据标准化、规范化采集以及数据库存储等方面还存在不足。为满足植物品种鉴定、保护、分类等工作，加快构建DNA指纹数据库检测平台、软件开发、数据化、自动化的研发成为亟待解决的问题[29-31]。
3.2遗传多样性分析
在生物的长期演化过程中，基因的多样性是物种分化和生命进化的基础，产生多样性的根本原因是遗传物质的改变。随着生物学尤其是遗传学和分子生物学的发展，检测遗传多样性的方法在不断提高和完善，目前SSR分子标记是进行遗传多样性分析最有效的方法之一。 黄丹娟[32]利用128个SSR 标记分析了我国茶树（Camellia sinensis）优良品种的遗传多样性水平，在254个茶树品种中共检测到629个等位变异，可将这些材料成功分类。匡猛等[33]对我国棉花（Gossypium cvs.）主栽品种进行了遗传相似性分析，表明了杂交种间的遗传差异大于常规种间的遗传差异，源于同一棉区的品种在一定程度上亲缘关系相近。段艳凤等[34]利用SSR标记构建了我国2000—2007年审定的88个马铃薯（Solanum tuberosum）品种的指纹图谱，同时进行的遗传多样性分析结果与供试材料系谱来源相符，并且同一栽培区域育成的品种在不同程度上聚在一类。范建光[28]选取788份西瓜种质材料进行了遗传多样性分析，在遗传距离为0.477处将所有材料分为5类。总之，利用SSR标记进行遗传距离、聚类分析，可将所研究的材料划分为不同的类群，为品种演化、类群分析提供参考；根据类群划分，选择育种材料时就可从大量的资源中快速选择，加快育种进程。
3.3种子纯度及真伪鉴定
我国是农业种植大国，种子的真实性和纯度是影响产量、质量最重要的因素，也是種子质量检验和新品种鉴定最重要的指标，直接影响种子企业的生存与否。因此，当前种子生产经营企业及行业主管部门需要一套快速、准确、可靠的检测技术，目前的检测方法主要有形态、生化和 DNA 分子标记3个层次。传统的形态鉴定法耗时耗力，易受外界因素影响，如气候条件变化、人为主观判断的影响；生化法稳定性差，且标记数量有限，不能满足生产和经营发展的要求；利用分子标记方法，鉴定高效、准确、数量多，且不易受环境、生长周期、季节影响，成为种子纯度及真伪鉴定技术必然的发展趋势[35]。 SSR 标记因多态性丰富、稳定性好、易操作等突出优点被广泛用于指纹图谱构建，进而进行的种子纯度及真伪鉴定具有可靠性。
王凤格等[31]对玉米（Zea mays）审定品种杂合率水平进行分析，平均品种杂合率达64%，主要集中在50%～80%（占89%），表明对大部分玉米审定品种而言，40对核心引物中均能筛选到20～30个双亲互补型引物，这对利用指纹库筛选玉米审定品种的纯度鉴定引物具有重要价值，利用杂交种指纹图谱及其互补带型，即可简便、准确鉴别出玉米杂交种的纯度及真伪[29]。石星星等[35]利用SSR标记对甘蓝杂交种进行真实性及纯度鉴定，结果与形态鉴定结果吻合，2种鉴定方法存在显著相关。
3.4遗传图谱构建及QTL定位
遗传图谱即遗传连锁图谱，是基因组研究中的一个重要组成部分。利用分子标记技术进行遗传图谱构建和数量性状位点（Quantitative Trait Locus，QTL）定位，找到与目标性状紧密连锁或者共分离的标记。近几年QTL定位应用广泛，在人类基因上与疾病有关的基因定位甚多，植物QTL研究主要集中在模式植物抗逆性基因的定位，借助标记辅助选择育种材料可以极大地缩短育种周期、提高育种效率[36]。目前已经有花生（Arachis hypogaea）、油菜、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）、大白菜（Brassica pekinensis）、大豆、玉米、棉花、茶树、梨（Pyrus cvs.）、橡胶树（Hevea brasiliensis）、柴胡（Bupleurum chinense）等基于SSR标记构建的遗传图谱。马建强[36] 以茶树变种间杂交构建的F1分离群体，采用SSR标记技术和简化基因组测序技术（Genotypingbysequencing，GBS），结合拟测交策略分别构建了双亲遗传图谱和双亲整合图谱，并对控制茶树新梢咖啡碱和可可碱含量以及芽叶形态等性状的QTL进行了定位分析。Moretzsohn等[37]利用SSR构建了花生（Arachis duranensis × stenosperma）遗传图谱，此后，洪彦彬等[38]基于 SSR 标记构建的1张花生栽培种分子遗传图谱包含108个标记、涉及20个连锁群，今后花生栽培种上新开发的标记将可直接用于遗传图谱的加密，也可作为花生重要性状的基因定位和QTL分析的框架。
3.5分子标记辅助育种
随着分子标记技术的快速发展，与传统育种技术相比，分子标记辅助选择育种更准确、更高效的特点，可使育种周期大大缩减，且成本降低，因此近年来越来越受到关注。这种生物技术与常规育种技术进行有机结合，将成为孕育植物遗传育种的又一次技术突破。冯常辉等[39]利用长江流域棉花育种重要亲本苏棉12和荆55173（感黄萎病）与抗黄萎病资源Sicala V1和中21373配制2套感病×抗病杂交组合（苏棉12×Sicala V1和荆55173×中21373），在其杂交组合的自交子代群体中挑选与黄萎病抗性相关的9个SSR标记实施分子标记辅助选择育种，通过单标记选择，8个SSR标记的aa与AA 2种基因型个体间的黄萎病校正病情指数差异达到极显著或者显著水平。刘红占[40]利用与抗白粉病基因Pm21共分离的SCAR标记和与抗白粉病基因PmAS846紧密连锁的SSR标记，作为抗病性定向选择分子标记，进行小麦抗病性鉴定和定向改良研究。
4讨论
与其他分子标记相比，SSR标记数量丰富、多态性高、分布于整个基因组、以孟德尔方式遗传、呈共显性的优点，在DNA指纹图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定等方面显示出独特的优越性。
目前分子生物实验室常见的电泳检测方法有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及毛细管电泳，前2种电泳方法分辨率低且数据读取不方便，但是其成本低，可以满足要求不高的试验需求，例如在前期大量筛选引物时使用，因此琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳成为普遍的电泳方法。在利用SSR标记构建指纹图谱及品种鉴定时，应用最多的是荧光毛细管电泳法，该方法高效、准确，然而其成本相对较高，主要表现在荧光引物电泳仪器昂贵、分子量内标价格高、荧光引物较普通引物合成成本高。为了降低成本，提高工作效率，科研工作者从试验当中总结经验摸索新方法，形成了高通量多重PCR、核心引物组合法、五色荧光多重电泳技术。赵久然等[29]在玉米DNA指纹研究中，为提高检测效率，通过多重PCR和五色荧光技术对每套引物构建稳定的十重PCR复合扩增体系。在小麦、棉花、水稻等众多植物SSR标记构建指纹图谱及遗传多样性研究中均采用引物组合法进行电泳，不仅使检测效率提高数倍，也使分子量内标成本节省数倍。 一種基于二代测序技术的SSR分型新方法SSRseq，几乎克服了现存所有检测方法的不足，尤其适合对多SSR位点、超高深度的分型，准确度高，并且分辨率达到单碱基水平。因此适合所有二倍体动植物及真核微生物的SSR位点分型。另外，还成功对六倍体植物油茶进行了SSR分型。对于多倍体物种来说，SSRseq可以提供不同等位基因的比例数据，从而提高多倍体物种遗传多样性分析的准确度，获得更加清晰的遗传结构图。虽然SSRseq有诸多优点，但也有一定的局限性：分型位点数和样本量较小时不合适；必须基于已知的染色体倍数才能得到不同等位基因间的相互比例。该技术是否可在其他多倍体、非整倍体植物中应用，在遗传分析、指纹图谱等分析中的实用性、适用性均有待进一步证实。
当前，国际植物新品种保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants ，UPOV）认为SSR标记和SNP技术（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP，单核苷酸多态性）是构建指纹图谱库最适合的2种技术，目前SSR标记技术最为成熟。与SSR相比，SNP标记是第三代分子标记，因其在基因组中密度更高、分布更均匀、更易实现数据整合比较、更高通量、可能与功能基因相关的优势，在分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面发挥了重要作用。近年来以SNP标记为基础构建的Bin图谱、高通量SNP芯片分型以及以SNP标记为基础进行群体进化研究等方面的应用已有大量的报道，SNP被视为最具发展潜力的标记技术。随着测序成本不断降低，SNP数据获得也越来越便利，例如简化基因组测序技术GBS，具有低成本、高通量、不依赖参考基因组、高效率的特点[41-42]，使以前人们望而却步的大样本全基因组基因分型成为了可能，这对进一步探明种质资源的遗传背景、系统演化具有深远意义[43-44]。通过拼接组装GBS获得的短读序列，可获得高密度SNP标记，并在遗传连锁图谱构建[45-47]、遗传群体分析[48]、全基因组关联分析（GWAS）[49-50]、种质鉴定[51]和辅助育种[52]等研究中开始大量应用。总体比较来说，SNP开发成本仍然高于SSR标记。在遗传多样性、品种鉴定等研究中，一般SSR标记即可满足需求，但是对于遗传背景复杂或者样品间相似性大的材料则需要SNP技术进行更准确、深入的研究分析。因此，SNP可作为SSR标记的补充数据库，加以完善。
总而言之，分子标记技术已经在植物分类及品种鉴定、种质资源亲缘关系及进化分析、观赏性状辅助选择、构建指纹图谱等方面得到了应用。西藏观赏植物种类繁多，基于分子标记的物种高效鉴定有助于物种保护和利用等工作的开展，从而更好地指导西藏花卉产业发展实践工作，形成高原生态安全屏障建设总规划条件下，符合西藏特点的生态产业。
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