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【摘 要】目的：探讨EGF/Gastrin联用促进胰岛新生可能的作用机制。方法：选用Wister大鼠，一次性腹腔注射STZ（55mg.kg-1）诱导1型糖尿病模型。实验分3组：正常对照组、糖尿病组及EGF/Gastrin联用治疗组。EGF（1μg.kg-1）/Gastrin（3μg.kg-1）每日一次，连续14日。实验结束时检测各组大鼠的空腹血糖、血清Insulin及C肽等生化指标；进行HE染色、Insulin和PDX-1免疫组织化学。结果：EGF/Gastrin组大鼠空腹血糖明显低于糖尿病组（P<0.05），血清Insulin和C肽含量、胰岛β细胞的数量明显高于糖尿病组（P<0.05）。结论：EGF/Gastrin联用能够降低糖尿病大鼠的血糖，并使血清Insulin 和C肽含量增加，胰岛β细胞数量增多、功能得到改善。EGF/Gastrin联用能够增强胰岛PDX-1的表达，此作用可能与其改善胰岛β细胞功能、降低血糖有关。
【关键词】EGF；Gastrin；胰岛新生；机制
【中图分类号】R587 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0049-03
糖尿病是一种严重危害人类身心健康和生活质量的全球性疾病。近年来，随着人们生活水平的不断提高和生活方式的日益改变，糖尿病的发病率呈现飞速增长的发展趋势，我国糖尿病的发病率已位居世界第2位。继胰腺移植、胰岛细胞移植之后，寻找能够刺激胰岛β细胞再生的药物及调控因子成为了目前人们研究的新焦点。研究胰岛新生及其调控因素不仅可以探讨糖尿病的发病机制，而且可能为糖尿病的治疗开辟新的途径。研究证实，EGF（ Epidermal Growth Factor）（ 表皮生长因子） /Gastrin（胃泌素）联合应用可促进胰岛新生、降低血糖并改善胰岛β细胞的功能[1-2]，而PDX-1（Pancreatic Duodenal Homeobox-1）（ 胰腺十二指肠同源盒-1）是Insulin（胰岛素）基因转录的主要调节因子，对促进胰腺发育和维持胰岛β细胞特异性基因的表达是必需的[3]。那么，EGF/Gastrin联用促进胰岛新生的同时是否也对PDX-1的表达产生了一定的影响？二者之间是否存在着某种联系？EGF/Gastrin联用促进胰岛新生的作用机制可否与调控PDX-1的表达有关呢？此即是我们在本实验中想探究的问题。
1 材料与方法
1.1 1型糖尿病大鼠模型的建立及分组 参考吴清洪等[4]糖尿病大鼠模型建立方法。取45只健康雄性Wistar大鼠，体重（200±20）g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供（许可证号：SCXK吉2003-001）。适应性饲养一周后，随机分为两组，正常对照组15只，实验组30只。实验组大鼠按照55mg.kg-1一次性腹腔注射STZ-枸橼酸钠缓冲液（Sigma）；正常对照组大鼠给予PH4.0枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。实验组大鼠以注射STZ 后第7天的空腹血糖值>16.65mmol.L-1者确定为1型糖尿病大鼠模型[5]。将成模的糖尿病大鼠随机再分为两组：糖尿病组和EGF/Gastrin组。正常对照组和糖尿病组给予PH8.0Tris-cl缓冲液，EGF/Gastrin组给予EGF（1μg.kg-1）（Invitrogen）/Gastrin（3μg.kg-1）（GenScript Corporation），皮下注射，每日一次，连续14日。
1.2 标本采集 实验结束时，采用10%水合氯醛（3ml.kg-1）麻醉动物，腹主动脉取血，离心后分离上层血清，保存于-20℃，用于各项生化指标的检测。处死大鼠后，立即切取胰腺组织，置于冰生理盐水中洗去残留血液，放入液氮中冷冻，而后置于-80℃超低温冰箱保存；其余部分浸入10%中性福尔马林固定液内固定，石蜡包埋切片，待组织学检查。
1.3 指标检测
1.3.1 一般状态 观察各组大鼠的进食量、饮水量、排尿量、体重、尿糖及其它一般状态。
1.3.2 空腹血糖值 禁食不禁水12h，鼠尾静脉采血，使用血糖测试仪分别于实验初、STZ注射后第7天、实验结束时检测。
1.3.3 血清Insulin及C肽含量 取冻存血清，放射免疫法检测并评估胰岛功能，Insulin放免试剂盒由华西糖尿病科技开发研究所提供。
1.3.4 HE染色 对已制备好的胰腺组织石蜡切片进行HE染色，观察糖尿病组胰岛破环情况及EGF/Gastrin组胰岛恢复情况。
1.3.5 免疫组织化学染色 采用S-P法，兔抗大鼠PDX-1多克隆抗体（Santa Cruz），小鼠抗大鼠Insulin单克隆抗体（北京博奥），观察各组大鼠Insulin 和PDX-1在胰腺组织中的表达变化。结果判定：以胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达细胞，并进行半定量分析，即每组随机选取10个含胰岛的视野（×400），使用Image-Pro plus 6.0 图像采集软件分析系统（OLYMPUS 日本），计算出阳性细胞占整个胰岛细胞的面积比（%），并进行统计学处理。
1.3.6 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件，应用方差分析处理数据。
2 结果
2.1 1型糖尿病大鼠模型
实验组30只大鼠有26只达到成模标准，成模率为87%。大鼠经STZ诱导24h后即表现出进食量、饮水量及排尿量增加；并且逐渐出现消瘦、毛色失去光泽、毛发凌乱、精神状态差、活动减少等症状。
2.2 空腹血糖变化
糖尿病组大鼠的空腹血糖值显著高于正常对照组（P<0.01），而EGF/Gastrin组则明显低于糖尿病组（P<0.05），但仍高于正常对照组（见表2.1）。
【关键词】EGF；Gastrin；胰岛新生；机制
【中图分类号】R587 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）03-0049-03
糖尿病是一种严重危害人类身心健康和生活质量的全球性疾病。近年来，随着人们生活水平的不断提高和生活方式的日益改变，糖尿病的发病率呈现飞速增长的发展趋势，我国糖尿病的发病率已位居世界第2位。继胰腺移植、胰岛细胞移植之后，寻找能够刺激胰岛β细胞再生的药物及调控因子成为了目前人们研究的新焦点。研究胰岛新生及其调控因素不仅可以探讨糖尿病的发病机制，而且可能为糖尿病的治疗开辟新的途径。研究证实，EGF（ Epidermal Growth Factor）（ 表皮生长因子） /Gastrin（胃泌素）联合应用可促进胰岛新生、降低血糖并改善胰岛β细胞的功能[1-2]，而PDX-1（Pancreatic Duodenal Homeobox-1）（ 胰腺十二指肠同源盒-1）是Insulin（胰岛素）基因转录的主要调节因子，对促进胰腺发育和维持胰岛β细胞特异性基因的表达是必需的[3]。那么，EGF/Gastrin联用促进胰岛新生的同时是否也对PDX-1的表达产生了一定的影响？二者之间是否存在着某种联系？EGF/Gastrin联用促进胰岛新生的作用机制可否与调控PDX-1的表达有关呢？此即是我们在本实验中想探究的问题。
1 材料与方法
1.1 1型糖尿病大鼠模型的建立及分组 参考吴清洪等[4]糖尿病大鼠模型建立方法。取45只健康雄性Wistar大鼠，体重（200±20）g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供（许可证号：SCXK吉2003-001）。适应性饲养一周后，随机分为两组，正常对照组15只，实验组30只。实验组大鼠按照55mg.kg-1一次性腹腔注射STZ-枸橼酸钠缓冲液（Sigma）；正常对照组大鼠给予PH4.0枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。实验组大鼠以注射STZ 后第7天的空腹血糖值>16.65mmol.L-1者确定为1型糖尿病大鼠模型[5]。将成模的糖尿病大鼠随机再分为两组：糖尿病组和EGF/Gastrin组。正常对照组和糖尿病组给予PH8.0Tris-cl缓冲液，EGF/Gastrin组给予EGF（1μg.kg-1）（Invitrogen）/Gastrin（3μg.kg-1）（GenScript Corporation），皮下注射，每日一次，连续14日。
1.2 标本采集 实验结束时，采用10%水合氯醛（3ml.kg-1）麻醉动物，腹主动脉取血，离心后分离上层血清，保存于-20℃，用于各项生化指标的检测。处死大鼠后，立即切取胰腺组织，置于冰生理盐水中洗去残留血液，放入液氮中冷冻，而后置于-80℃超低温冰箱保存；其余部分浸入10%中性福尔马林固定液内固定，石蜡包埋切片，待组织学检查。
1.3 指标检测
1.3.1 一般状态 观察各组大鼠的进食量、饮水量、排尿量、体重、尿糖及其它一般状态。
1.3.2 空腹血糖值 禁食不禁水12h，鼠尾静脉采血，使用血糖测试仪分别于实验初、STZ注射后第7天、实验结束时检测。
1.3.3 血清Insulin及C肽含量 取冻存血清，放射免疫法检测并评估胰岛功能，Insulin放免试剂盒由华西糖尿病科技开发研究所提供。
1.3.4 HE染色 对已制备好的胰腺组织石蜡切片进行HE染色，观察糖尿病组胰岛破环情况及EGF/Gastrin组胰岛恢复情况。
1.3.5 免疫组织化学染色 采用S-P法，兔抗大鼠PDX-1多克隆抗体（Santa Cruz），小鼠抗大鼠Insulin单克隆抗体（北京博奥），观察各组大鼠Insulin 和PDX-1在胰腺组织中的表达变化。结果判定：以胞质或胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达细胞，并进行半定量分析，即每组随机选取10个含胰岛的视野（×400），使用Image-Pro plus 6.0 图像采集软件分析系统（OLYMPUS 日本），计算出阳性细胞占整个胰岛细胞的面积比（%），并进行统计学处理。
1.3.6 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件，应用方差分析处理数据。
2 结果
2.1 1型糖尿病大鼠模型
实验组30只大鼠有26只达到成模标准，成模率为87%。大鼠经STZ诱导24h后即表现出进食量、饮水量及排尿量增加；并且逐渐出现消瘦、毛色失去光泽、毛发凌乱、精神状态差、活动减少等症状。
2.2 空腹血糖变化
糖尿病组大鼠的空腹血糖值显著高于正常对照组（P<0.01），而EGF/Gastrin组则明显低于糖尿病组（P<0.05），但仍高于正常对照组（见表2.1）。