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摘 要：为提高微生物实验室金黄色葡萄球菌的检测能力，于2020年参加乳粉中金黄色葡萄球定量检测能力验证，依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）进行检验，同时应用科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板和3M金黄色葡萄球菌测试片作为对照手段进行实验，并应用VITEK2进行生化鉴定，确保实验结果的准确性。结果表明，样品CODE TF02490061结果报告为1 100 CFU/g、样品CODE TF02490062结果报告为4 800 CFU/g，反馈结果为满意，z值均<2。
关键词：金黄色葡萄球菌;能力验证;平板计数
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种食源性病原菌，为无芽孢、无鞭毛的革兰氏阳性球菌。金黄色葡萄球菌是食品致病菌污染主要的病原菌，其产生的肠毒素可引起食物中毒，导致腹泻和上呼吸道感染[1];该菌也可以引起局部化脓炎症感染、肺炎、心包炎等，甚至导致败血症、脓毒症等全身感染[2]。
能力验证活动是利用实验室间的比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力[3]。為有效提高实验室检测水平和人员技术能力，辽宁省检验检测认证中心于2020年参加了中国食品药品检定研究院组织的乳粉中金黄色葡萄球菌定量检测（NIFDC-PT-249）能力验证。
1 材料与方法
1.1 样品
待测能力验证样品为两件，每件样品由1个菌球及相应奶粉组成，编码分别为CODE TF02490061、CODE TF02490062。在生物安全柜内将金黄色葡萄球菌样品的西林瓶打开，将西林瓶内小球加入到225 mL无菌生理盐水稀释液中，充分溶解，然后再将与西林瓶相同编码的奶粉样品加入到上述稀释液中，充分均质混匀。依此方法，分别对2件样品进行处理。
1.2 试剂和仪器
金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538及表皮葡萄球菌标准菌株ATCC12228，购自广东环凯微生物有限公司;Baird-Parker平板（B-P平板）、0.85%无菌生理盐水、平板计数琼脂（PCA）、革兰氏染色液、脑心浸出液肉汤（BHI），均购自北京陆桥技术股份有限公司;冻干兔血（美国BD公司）;浆金黄色葡萄球菌显色平板（法国科玛嘉公司）;金黄色葡萄球菌测试片（美国3M公司）;革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP卡）（法国梅里埃公司）。
A2型生物安全柜（美国NUAIRE公司）;电热恒温培养箱（德国Binder公司）;生物显微镜（日本奥林帕斯公司）;高压灭菌锅（日本Tomy公司）;均质器（法国梅里埃公司）;VITEK 2全自动微生物生化鉴定系统（法国梅里埃公司）。
1.3 方法
依据作业指导书及《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[4]第二法平板计数法进行检测。同时用科玛嘉金葡显色平板和金葡测试片作为对照手段进行实验，金葡显色平板每皿接种量为0.1 mL，3M金葡测试片每片接种量为1 mL。
2 结果与分析
2.1 典型菌落计数
金黄色葡萄球菌在B-P平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2～3 mm，颜色灰黑至黑色，有光泽，周围有不透明圈（沉淀环），其外有一透明圈（卵磷脂环），菌落有黄油样粘稠感;在金葡显色培养基上显紫红色，其他菌显蓝绿色或无色;在3M金葡测试片上为紫红色点，需要确认片进行确认。典型菌落特征见图1。
选择同一稀释度所有典型菌落数合计在20～200 CFU的平板，计数典型菌落数。金黄色葡萄球菌3种计数方法结果见表1，可见3种方法结果无明显差异，3个结果都在同一数量级上。
2.2 确证试验（鉴定）
从CODETF02490061和CODE TF02490062适宜稀释度的B-P平板典型菌落中选取5个菌落，分别做革兰氏染色镜检和血浆凝固酶试验，并应用VITEK2进行生化鉴定，确保实验结果的准确性。
2.2.1 染色镜检
取典型菌落进行革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阳性球菌，直径为0.5～1.0 μm，显微镜下排列成葡萄串状排列。
2.2.2 血浆凝固酶试验
挑取B-P平板上典型菌落5个，进行血浆凝固酶试验，同时以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉汤培养物作对照，典型菌落和阳性菌株对照血浆凝固酶试验均在2 h产生凝固，阴性菌株对照菌株观察6 h不产生凝固。典型菌落均为血浆凝固酶阳性，阳性比例为100%。
2.2.3 VITEK2生化鉴定
将挑取B-P平板上典型菌落划线接种至PCA平板，36 ℃
培养24 h，取新鲜培养的菌落进行VITEK2生化仪器鉴定，鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，说明B-P平板对金黄色葡萄球菌的选择性非常好，特征明显能够明确区别于其他葡萄球菌。
2.3 结果报告及反馈
以国家标准方法结果为本次能力验证的报告结果，即证实为金黄色葡萄球菌菌落阳性比例乘以相应稀释度B-P平板计数典型菌落数，再乘以稀释倍数，为样品中金黄色葡萄球菌结果报告数，单位为CFU/g。编号CODE TF02490061样品结果报告为1 100 CFU/g，编号CODE TF02490062样品结果报告为4 800 CFU/g。
经能力验证组织机构反馈，本实验室CODE TF02490061
金黄色葡萄球菌的检测结果为3.041，指定值为3.176，z值为-0.5;CODE TF02490062金黄色葡萄球菌的检测结果为3.681，指定值为3.712，z值为-0.1;z值均<2，两个样品的结果评价为满意。
3 结论与讨论
本能力验证中采用多种方法同步进行金黄色葡萄球菌检测，以保证实验室检测结果的准确性。3种计数方法结果无明显差异，3个结果均在同一数量级上，说明实验准确无误，B-P平板与金葡显色平板计数结果相近，而3M金葡测试片计数结果略低。金葡测试片中相对营养成分较少，且含有抑制其他菌生长的物质[5]，故其检测结果略低。最后的结果报告以B-P平板上菌落数为主，金葡显色平板和3M金葡测试片上的菌落数为参考，经反馈两个样品的结果评价为满意。
金黄色葡萄球菌检测的关键控制点，①在实验前将B-P平板提前放在培养箱中，使平板表面干燥。涂布时用L棒小心涂匀，注意不要触及平板边缘，涂布后先正置培养，保证水分完全吸收后再倒置培养，以免细菌在平板边缘缝隙生长，影响观察计数。②进行血浆凝固酶试验时，以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉汤培养物作对照，典型菌落和阳性菌株对照血浆凝固酶试验应在6 h内产生凝固，阴性菌株对照菌株观察6 h不产生凝固，以确保血浆凝固酶试验准确。
参考文献
[1]曾博雅.食品微生物金黄色葡萄球菌定量检测能力验证[J].现代食品，2020（11）：176-177.
[2]刘云国.食品卫生微生物学标准鉴定图谱[M].北京：科学出版社，2009.
[3]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则：CNAS-RL02：2018[S].北京：中国标准出版社，2018.
[4]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[5]范田丽，付晓静，吴海江.金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果与分析[J].现代食品，2020（3）：196-198.
关键词：金黄色葡萄球菌;能力验证;平板计数
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种食源性病原菌，为无芽孢、无鞭毛的革兰氏阳性球菌。金黄色葡萄球菌是食品致病菌污染主要的病原菌，其产生的肠毒素可引起食物中毒，导致腹泻和上呼吸道感染[1];该菌也可以引起局部化脓炎症感染、肺炎、心包炎等，甚至导致败血症、脓毒症等全身感染[2]。
能力验证活动是利用实验室间的比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力[3]。為有效提高实验室检测水平和人员技术能力，辽宁省检验检测认证中心于2020年参加了中国食品药品检定研究院组织的乳粉中金黄色葡萄球菌定量检测（NIFDC-PT-249）能力验证。
1 材料与方法
1.1 样品
待测能力验证样品为两件，每件样品由1个菌球及相应奶粉组成，编码分别为CODE TF02490061、CODE TF02490062。在生物安全柜内将金黄色葡萄球菌样品的西林瓶打开，将西林瓶内小球加入到225 mL无菌生理盐水稀释液中，充分溶解，然后再将与西林瓶相同编码的奶粉样品加入到上述稀释液中，充分均质混匀。依此方法，分别对2件样品进行处理。
1.2 试剂和仪器
金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538及表皮葡萄球菌标准菌株ATCC12228，购自广东环凯微生物有限公司;Baird-Parker平板（B-P平板）、0.85%无菌生理盐水、平板计数琼脂（PCA）、革兰氏染色液、脑心浸出液肉汤（BHI），均购自北京陆桥技术股份有限公司;冻干兔血（美国BD公司）;浆金黄色葡萄球菌显色平板（法国科玛嘉公司）;金黄色葡萄球菌测试片（美国3M公司）;革兰氏阳性细菌鉴定卡（GP卡）（法国梅里埃公司）。
A2型生物安全柜（美国NUAIRE公司）;电热恒温培养箱（德国Binder公司）;生物显微镜（日本奥林帕斯公司）;高压灭菌锅（日本Tomy公司）;均质器（法国梅里埃公司）;VITEK 2全自动微生物生化鉴定系统（法国梅里埃公司）。
1.3 方法
依据作业指导书及《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》（GB 4789.10—2016）[4]第二法平板计数法进行检测。同时用科玛嘉金葡显色平板和金葡测试片作为对照手段进行实验，金葡显色平板每皿接种量为0.1 mL，3M金葡测试片每片接种量为1 mL。
2 结果与分析
2.1 典型菌落计数
金黄色葡萄球菌在B-P平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2～3 mm，颜色灰黑至黑色，有光泽，周围有不透明圈（沉淀环），其外有一透明圈（卵磷脂环），菌落有黄油样粘稠感;在金葡显色培养基上显紫红色，其他菌显蓝绿色或无色;在3M金葡测试片上为紫红色点，需要确认片进行确认。典型菌落特征见图1。
选择同一稀释度所有典型菌落数合计在20～200 CFU的平板，计数典型菌落数。金黄色葡萄球菌3种计数方法结果见表1，可见3种方法结果无明显差异，3个结果都在同一数量级上。
2.2 确证试验（鉴定）
从CODETF02490061和CODE TF02490062适宜稀释度的B-P平板典型菌落中选取5个菌落，分别做革兰氏染色镜检和血浆凝固酶试验，并应用VITEK2进行生化鉴定，确保实验结果的准确性。
2.2.1 染色镜检
取典型菌落进行革兰氏染色，镜检结果为革兰氏阳性球菌，直径为0.5～1.0 μm，显微镜下排列成葡萄串状排列。
2.2.2 血浆凝固酶试验
挑取B-P平板上典型菌落5个，进行血浆凝固酶试验，同时以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉汤培养物作对照，典型菌落和阳性菌株对照血浆凝固酶试验均在2 h产生凝固，阴性菌株对照菌株观察6 h不产生凝固。典型菌落均为血浆凝固酶阳性，阳性比例为100%。
2.2.3 VITEK2生化鉴定
将挑取B-P平板上典型菌落划线接种至PCA平板，36 ℃
培养24 h，取新鲜培养的菌落进行VITEK2生化仪器鉴定，鉴定结果均为金黄色葡萄球菌，说明B-P平板对金黄色葡萄球菌的选择性非常好，特征明显能够明确区别于其他葡萄球菌。
2.3 结果报告及反馈
以国家标准方法结果为本次能力验证的报告结果，即证实为金黄色葡萄球菌菌落阳性比例乘以相应稀释度B-P平板计数典型菌落数，再乘以稀释倍数，为样品中金黄色葡萄球菌结果报告数，单位为CFU/g。编号CODE TF02490061样品结果报告为1 100 CFU/g，编号CODE TF02490062样品结果报告为4 800 CFU/g。
经能力验证组织机构反馈，本实验室CODE TF02490061
金黄色葡萄球菌的检测结果为3.041，指定值为3.176，z值为-0.5;CODE TF02490062金黄色葡萄球菌的检测结果为3.681，指定值为3.712，z值为-0.1;z值均<2，两个样品的结果评价为满意。
3 结论与讨论
本能力验证中采用多种方法同步进行金黄色葡萄球菌检测，以保证实验室检测结果的准确性。3种计数方法结果无明显差异，3个结果均在同一数量级上，说明实验准确无误，B-P平板与金葡显色平板计数结果相近，而3M金葡测试片计数结果略低。金葡测试片中相对营养成分较少，且含有抑制其他菌生长的物质[5]，故其检测结果略低。最后的结果报告以B-P平板上菌落数为主，金葡显色平板和3M金葡测试片上的菌落数为参考，经反馈两个样品的结果评价为满意。
金黄色葡萄球菌检测的关键控制点，①在实验前将B-P平板提前放在培养箱中，使平板表面干燥。涂布时用L棒小心涂匀，注意不要触及平板边缘，涂布后先正置培养，保证水分完全吸收后再倒置培养，以免细菌在平板边缘缝隙生长，影响观察计数。②进行血浆凝固酶试验时，以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538和表皮葡萄球菌ATCC12228的肉汤培养物作对照，典型菌落和阳性菌株对照血浆凝固酶试验应在6 h内产生凝固，阴性菌株对照菌株观察6 h不产生凝固，以确保血浆凝固酶试验准确。
参考文献
[1]曾博雅.食品微生物金黄色葡萄球菌定量检测能力验证[J].现代食品，2020（11）：176-177.
[2]刘云国.食品卫生微生物学标准鉴定图谱[M].北京：科学出版社，2009.
[3]中国合格评定国家认可委员会.能力验证规则：CNAS-RL02：2018[S].北京：中国标准出版社，2018.
[4]国家食品药品监督管理总局，国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验：GB 4789.10—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.
[5]范田丽，付晓静，吴海江.金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果与分析[J].现代食品，2020（3）：196-198.