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【摘 要】 目的：考察好要汤对雌性小鼠卵巢功能的影响。方法：给药后对雌性小鼠的阴道角化上皮细胞、子宫和卵巢的体重及指数、孕酮P的含量、卵巢和子宫的形态学等方面观察。结果：与空白组比较，好要汤中、高劑量组（4.5、6.8 g/kg）均能不同程度地延长雌性小鼠的动情期，角化上皮细胞阳性率明显升高，好要汤高剂量组（6.8 g/kg）能增大小鼠的卵巢指数，提高血清孕酮P含量，明显增加黄体数目。结论：好要汤有防止卵巢衰老功效。
【关键词】 好要汤；排卵；阴道角化上皮细胞；孕酮P
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）12-0035-05
Abstract：Objective To investigate the effect of Haoyaotang powders on ovary function of female mice. Methods The vaginal keratinocyte， the weight and index of uterus and ovary， the content of progesterone P， the morphology of ovary and uterus in female mice were observed after administration. Results Compared with the blank group， medium and high dose group of Haoyaotang powders（4.5、6.8 g·kg-1） can significantly prolong estrus in female mice， the positive ratio of keratinized epithelial cells increased significantly， high dose group of Haoyaotang powders（6.8 g·kg-1） can increase the ovarian index， enhance the content of serum progesterone P and increase the number of corpora luteum of female mice. Conclusion Haoyaotang powders can anti-age the ovarian of female mice.
Keywords：Haoyaotang Powders； Ovary Function； Keratinized Epithelial Cells； Progesterone P
好要汤具有缓解劳累、促进产后恢复的功能，源于妇科临床补肾强腰方，含覆盆子、黄精、玉竹、酸枣仁等中药，具有益气扶正、补肝肾的功效，可缓解体力疲劳，提高人体精力，预防早衰，促进人体各项功能恢复[1]。研究通过观察给药后对雌性小鼠的阴道角化上皮细胞、子宫和卵巢的体重及指数、孕酮P的含量、卵巢和子宫的形态学等方面的变化，考察好要汤的促排卵功效，为其科学合理运用提供科学依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Honour Intrument Shaker欧诺摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；Top Pette8-Channer Pipettor移液排枪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）；MNT-150美耐特原点数显卡尺（上海美耐特实业有限公司）；OLYMPUS CKX41倒置式生物显微镜（北京中仪光科科技发展有限公司）；ELX800通用酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。
1.2 药物与试剂 好要汤（批号：170521，广禾堂草本科技（上海）有限公司）；定坤丹（批号：139170102，山西广誉远国药有限公司）；孕酮P试剂盒（上海通蔚实业有限公司）；4%多聚甲醛固定液（批号：20160314，武汉谷歌生物科技有限公司）。
1.3 动物 SPF级昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22 g，南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（粤）2016-0041，广东药科大学实验动物中心饲养实验。
2 方法
2.1 分组及给药 取雌性小鼠75只，随机为5组，空白组，定坤丹组，好要汤低、中、高剂量组，适应性喂养5 d后，根据体重逐只给药，连续给药15 d。空白组灌胃生理盐水，阳性组选用定坤丹，给药量为临床等效量（1.62 g/kg），好要汤高剂量组（6.8 g/kg，临床等效量的1.5倍），好要汤中剂量组（4.5 g/kg，临床等效量），好要汤低剂量组（3 g/kg，临床等效量的0.67倍）。
2.2 阴道角化上皮细胞检查[1] 于给药第10 d后每日上午9时，各组小鼠每日阴道涂片1次。将无菌棉签用生理盐水浸湿后插入小鼠阴道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上轻轻滚动，使分泌物均匀地涂布于玻片上，自然风干，以新配制的5%美蓝溶液（95%乙醇溶液配制）染色，2 h后用水漂去多余染色液，待干，置于生物显微镜下观察阴道角化上皮细胞的情况，连续涂片1个动情周期（5 d）。以角化上皮细胞面积大于涂片总面积的50%作为阳性判断标准，计算阳性率[2]。
2.3 血清中孕酮P水平检测 末次给药1 h后，各组小鼠均用摘眼球法取血，将所取血液静置2 h后，离心（3000 r/min，10 min），分离血清，按照试剂盒说明书操作。测定小鼠血清中孕酮P的含量。孕酮P酶联免疫分析（ELISA）的具体操作步骤如下：①标准品的加样：设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。②加样：分别设置空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加带测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不要触及孔壁，轻轻晃动混匀。③加酶：每孔用移液排枪加酶标试剂100 μL，除空白空外。④温育：用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。⑤配液：用20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。⑥洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。⑦显色：每孔先加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。⑧终止：每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立即转蓝色）。⑨测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。测定应在加终止液后15 min内进行。⑩计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线，得出直线回归方程式，根据样品的OD值算出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度[3-4]。 2.4 子宫、卵巢指数测定末次给药1 h后，摘眼球取血后迅速将小鼠处死，剖开腹腔，取出子宫和两侧卵巢，剥离周围组织和脂肪，迅速以电子天平称量子宫和卵巢的湿重。换算成脏器指数：子宫指数=子宫重量（mg） /100 g体重，卵巢指数=卵巢重量（mg） /100 g体重。
2.5 子宫和卵巢组织形态学检查将所取的新鲜子宫和卵巢组织标本以4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水，浸蜡包埋，切片，HE染色。生物学显微镜检并摄像，观察组织形态学变化，并记录双侧卵巢切片中各级卵泡总数和黄体数目。
2.6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 对阴道上角化细胞的影响 空白组小鼠在涂片的5 d内，动情前期、动情期、动情后期和动情间期的周期性变化比较明显，可观察到角化上皮细胞数量和白细胞数量呈反比的规律性变化。其余组表现为阴道脱落细胞性周期延长、不规则，在采样时间内可观察到阴道涂片上出现成片或团块的角化上皮细胞，只有少量的白细胞。定坤丹组、好要汤中剂量组和高剂量组均能不同程度地延长雌性小鼠的动情期，角化上皮细胞大于50%的阳性率与空白组比较，差异有统计学意义（P <0.05或P <0.01）。定坤丹组和好要汤高剂量组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3.2 对血清中孕酮P含量的影响 与空白组比较，好要汤组（3、4.5、6.8 g/kg）能不同程度地升高小鼠血清中孕酮P含量；好要汤高剂量组（6.8 g/kg）与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1、表2。
3.3 对子宫和卵巢形态、脏器指数及各级卵泡总数的影响
3.3.1 对小鼠体重、脏器指数的影响 好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与空白组比较，体重无明显变化，子宫重量有所增加，子宫指数稍大，但差异均无统计学意义（P>0.05）；好要汤高剂量组与空白组比较，卵巢重量明显增加，卵巢指数明显增大，差异有统计学意义（P<0.01）。好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与定坤丹组比较，小鼠体重、子宫重量、子宫指数均无统计学差异（P>0.05）；好要汤中、低剂量组与定坤丹组比较，卵巢重量偏小，卵巢指数偏低，差异有统计学意义（P<0.01）；好要汤高剂量组与定坤丹組比，两者卵巢重量和卵巢指数均无统计学差异（P>0.05），即高剂量的好要汤能增大小鼠的卵巢重量和卵巢指数。见表3。
3.3.2 对子宫和卵巢形态的观察 由子宫切片（见图2）和卵巢切片（见图3）可得，空白组子宫腔内膜上皮厚度较薄，腺腔轻度扩张，血管较少；卵巢体积稍小，色泽苍白，卵泡结构不清，或囊泡呈原始状态。卵巢皮质部可见不同发育阶段的卵泡，可见少量黄体和白体形成，未见囊性卵泡，可见适量脂滴。好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与空白组比较，子宫外观粗大发紫，宫腔内膜上皮变厚，腺腔扩张，可见核下空泡，间质疏松；卵巢色泽更鲜艳，卵泡明显增大，卵泡未见明显的囊性扩张、细胞变形、坏死炎细胞浸润等病变；髓质未见充血、水肿及炎细胞浸润。表面见较多黄体，黄体的颗粒细胞发育良好，形态完整，排列整齐紧致[5]。
3.4 对卵巢中各级卵泡总数和黄体数目的影响 由表4可知，好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与空白组相比，卵泡总数有明显增加的趋势，但两者差异无统计学意义（P>0.05）；好要汤低剂量组、中剂量组与空白比较，黄体数目无统计学差异（P>0.05），高剂量组（6.8 g/kg）与空白组比较，黄体数目明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
。
4 讨论
中医认为，肾虚主要体现在腰膝酸痛、腿软、耳鸣耳聋、齿发脱落、失眠多梦、潮热盗汗、性功能减退、女子经少、经闭或卵巢早衰等方面，其症状与现代医学理论中疲劳或慢性疲劳综合征的症状基本一致，都是人生理机能衰退的表现[6-7]。因此，缓解体力疲劳、提高精力、养生保健及防止衰老等，都可从补养肾精肾气入手调理[8]。传统中医药重视调动人体自身的免疫力，达到抗疲劳能力，在对抗疲劳，提高精力，抗衰老方面有着得天独厚的优势，同时具有安全有效，毒副作用小的特点。因此，研发出具有毒副作用小、疗效良好、可长期服用的中药功能食品，将具有较大的市场发展潜力。
好要汤可延长雌性小鼠的动情期，明显升高角化上皮细胞阳性率，增大小鼠的卵巢指数，提高孕酮P含量，明显增加黄体数目，阐释了好要汤方温补肾阳的现代科学内涵[8]。
参考文献
[1]徐晓娟，金沈锐，秦旭华.右归丸水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮分泌的影响及机制[J].四川中医，2006，24（5）：22-23.
[2]白静. 补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞BMP-15及其Smads信号通路影响的研究[D].石家庄：河北医科大学，2013.
[3]蔡平平.多囊卵巢综合征内皮细胞损伤及活血化瘀法对其影响[D].广州：广州中医药大学，2006.
[4]王瑞杰，李晖，孙红，等.调经助孕胶囊对着床障碍小鼠胚泡着床位点数和雌、孕激素及其受体的影响[J].中国药房， 2016， 27（19）：2629-2631.
[5]杨丽芸，杜惠兰，白静，等.补肾法、疏肝法对超促排卵小鼠卵母细胞数量及GDF-9表达的影响[J]. 中医杂志， 2013， 54（7）：597-600.
[6]阳松威，孙晓峰，贺又舜，等.左归丸对化疗致卵巢早衰小鼠卵巢功能的影响[J].中成药，2016，38（4）：717-722.
[7]康艳南，满玉晶，冷杨阳，等.卵巢早衰中西医发病机制研究[J].光明中医，2015，30（2）：358-359.
[8]包蕾，张绍芬，张月萍.卵巢功能早衰的研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2011，30（6）：479-483.
（收稿日期：2018-04-13 编辑：程鹏飞）
【关键词】 好要汤；排卵；阴道角化上皮细胞；孕酮P
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）12-0035-05
Abstract：Objective To investigate the effect of Haoyaotang powders on ovary function of female mice. Methods The vaginal keratinocyte， the weight and index of uterus and ovary， the content of progesterone P， the morphology of ovary and uterus in female mice were observed after administration. Results Compared with the blank group， medium and high dose group of Haoyaotang powders（4.5、6.8 g·kg-1） can significantly prolong estrus in female mice， the positive ratio of keratinized epithelial cells increased significantly， high dose group of Haoyaotang powders（6.8 g·kg-1） can increase the ovarian index， enhance the content of serum progesterone P and increase the number of corpora luteum of female mice. Conclusion Haoyaotang powders can anti-age the ovarian of female mice.
Keywords：Haoyaotang Powders； Ovary Function； Keratinized Epithelial Cells； Progesterone P
好要汤具有缓解劳累、促进产后恢复的功能，源于妇科临床补肾强腰方，含覆盆子、黄精、玉竹、酸枣仁等中药，具有益气扶正、补肝肾的功效，可缓解体力疲劳，提高人体精力，预防早衰，促进人体各项功能恢复[1]。研究通过观察给药后对雌性小鼠的阴道角化上皮细胞、子宫和卵巢的体重及指数、孕酮P的含量、卵巢和子宫的形态学等方面的变化，考察好要汤的促排卵功效，为其科学合理运用提供科学依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 Honour Intrument Shaker欧诺摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；Top Pette8-Channer Pipettor移液排枪（大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）；MNT-150美耐特原点数显卡尺（上海美耐特实业有限公司）；OLYMPUS CKX41倒置式生物显微镜（北京中仪光科科技发展有限公司）；ELX800通用酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。
1.2 药物与试剂 好要汤（批号：170521，广禾堂草本科技（上海）有限公司）；定坤丹（批号：139170102，山西广誉远国药有限公司）；孕酮P试剂盒（上海通蔚实业有限公司）；4%多聚甲醛固定液（批号：20160314，武汉谷歌生物科技有限公司）。
1.3 动物 SPF级昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22 g，南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（粤）2016-0041，广东药科大学实验动物中心饲养实验。
2 方法
2.1 分组及给药 取雌性小鼠75只，随机为5组，空白组，定坤丹组，好要汤低、中、高剂量组，适应性喂养5 d后，根据体重逐只给药，连续给药15 d。空白组灌胃生理盐水，阳性组选用定坤丹，给药量为临床等效量（1.62 g/kg），好要汤高剂量组（6.8 g/kg，临床等效量的1.5倍），好要汤中剂量组（4.5 g/kg，临床等效量），好要汤低剂量组（3 g/kg，临床等效量的0.67倍）。
2.2 阴道角化上皮细胞检查[1] 于给药第10 d后每日上午9时，各组小鼠每日阴道涂片1次。将无菌棉签用生理盐水浸湿后插入小鼠阴道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上轻轻滚动，使分泌物均匀地涂布于玻片上，自然风干，以新配制的5%美蓝溶液（95%乙醇溶液配制）染色，2 h后用水漂去多余染色液，待干，置于生物显微镜下观察阴道角化上皮细胞的情况，连续涂片1个动情周期（5 d）。以角化上皮细胞面积大于涂片总面积的50%作为阳性判断标准，计算阳性率[2]。
2.3 血清中孕酮P水平检测 末次给药1 h后，各组小鼠均用摘眼球法取血，将所取血液静置2 h后，离心（3000 r/min，10 min），分离血清，按照试剂盒说明书操作。测定小鼠血清中孕酮P的含量。孕酮P酶联免疫分析（ELISA）的具体操作步骤如下：①标准品的加样：设置标准品孔和样品孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。②加样：分别设置空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加带测样品10 μL（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不要触及孔壁，轻轻晃动混匀。③加酶：每孔用移液排枪加酶标试剂100 μL，除空白空外。④温育：用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。⑤配液：用20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。⑥洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。⑦显色：每孔先加显色剂A 50 μL，再加显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。⑧终止：每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立即转蓝色）。⑨测定：以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。测定应在加终止液后15 min内进行。⑩计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线，得出直线回归方程式，根据样品的OD值算出相应的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度[3-4]。 2.4 子宫、卵巢指数测定末次给药1 h后，摘眼球取血后迅速将小鼠处死，剖开腹腔，取出子宫和两侧卵巢，剥离周围组织和脂肪，迅速以电子天平称量子宫和卵巢的湿重。换算成脏器指数：子宫指数=子宫重量（mg） /100 g体重，卵巢指数=卵巢重量（mg） /100 g体重。
2.5 子宫和卵巢组织形态学检查将所取的新鲜子宫和卵巢组织标本以4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水，浸蜡包埋，切片，HE染色。生物学显微镜检并摄像，观察组织形态学变化，并记录双侧卵巢切片中各级卵泡总数和黄体数目。
2.6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，组间比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 对阴道上角化细胞的影响 空白组小鼠在涂片的5 d内，动情前期、动情期、动情后期和动情间期的周期性变化比较明显，可观察到角化上皮细胞数量和白细胞数量呈反比的规律性变化。其余组表现为阴道脱落细胞性周期延长、不规则，在采样时间内可观察到阴道涂片上出现成片或团块的角化上皮细胞，只有少量的白细胞。定坤丹组、好要汤中剂量组和高剂量组均能不同程度地延长雌性小鼠的动情期，角化上皮细胞大于50%的阳性率与空白组比较，差异有统计学意义（P <0.05或P <0.01）。定坤丹组和好要汤高剂量组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
3.2 对血清中孕酮P含量的影响 与空白组比较，好要汤组（3、4.5、6.8 g/kg）能不同程度地升高小鼠血清中孕酮P含量；好要汤高剂量组（6.8 g/kg）与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1、表2。
3.3 对子宫和卵巢形态、脏器指数及各级卵泡总数的影响
3.3.1 对小鼠体重、脏器指数的影响 好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与空白组比较，体重无明显变化，子宫重量有所增加，子宫指数稍大，但差异均无统计学意义（P>0.05）；好要汤高剂量组与空白组比较，卵巢重量明显增加，卵巢指数明显增大，差异有统计学意义（P<0.01）。好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与定坤丹组比较，小鼠体重、子宫重量、子宫指数均无统计学差异（P>0.05）；好要汤中、低剂量组与定坤丹组比较，卵巢重量偏小，卵巢指数偏低，差异有统计学意义（P<0.01）；好要汤高剂量组与定坤丹組比，两者卵巢重量和卵巢指数均无统计学差异（P>0.05），即高剂量的好要汤能增大小鼠的卵巢重量和卵巢指数。见表3。
3.3.2 对子宫和卵巢形态的观察 由子宫切片（见图2）和卵巢切片（见图3）可得，空白组子宫腔内膜上皮厚度较薄，腺腔轻度扩张，血管较少；卵巢体积稍小，色泽苍白，卵泡结构不清，或囊泡呈原始状态。卵巢皮质部可见不同发育阶段的卵泡，可见少量黄体和白体形成，未见囊性卵泡，可见适量脂滴。好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与空白组比较，子宫外观粗大发紫，宫腔内膜上皮变厚，腺腔扩张，可见核下空泡，间质疏松；卵巢色泽更鲜艳，卵泡明显增大，卵泡未见明显的囊性扩张、细胞变形、坏死炎细胞浸润等病变；髓质未见充血、水肿及炎细胞浸润。表面见较多黄体，黄体的颗粒细胞发育良好，形态完整，排列整齐紧致[5]。
3.4 对卵巢中各级卵泡总数和黄体数目的影响 由表4可知，好要汤（3、4.5、6.8 g/kg）组与空白组相比，卵泡总数有明显增加的趋势，但两者差异无统计学意义（P>0.05）；好要汤低剂量组、中剂量组与空白比较，黄体数目无统计学差异（P>0.05），高剂量组（6.8 g/kg）与空白组比较，黄体数目明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
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4 讨论
中医认为，肾虚主要体现在腰膝酸痛、腿软、耳鸣耳聋、齿发脱落、失眠多梦、潮热盗汗、性功能减退、女子经少、经闭或卵巢早衰等方面，其症状与现代医学理论中疲劳或慢性疲劳综合征的症状基本一致，都是人生理机能衰退的表现[6-7]。因此，缓解体力疲劳、提高精力、养生保健及防止衰老等，都可从补养肾精肾气入手调理[8]。传统中医药重视调动人体自身的免疫力，达到抗疲劳能力，在对抗疲劳，提高精力，抗衰老方面有着得天独厚的优势，同时具有安全有效，毒副作用小的特点。因此，研发出具有毒副作用小、疗效良好、可长期服用的中药功能食品，将具有较大的市场发展潜力。
好要汤可延长雌性小鼠的动情期，明显升高角化上皮细胞阳性率，增大小鼠的卵巢指数，提高孕酮P含量，明显增加黄体数目，阐释了好要汤方温补肾阳的现代科学内涵[8]。
参考文献
[1]徐晓娟，金沈锐，秦旭华.右归丸水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮分泌的影响及机制[J].四川中医，2006，24（5）：22-23.
[2]白静. 补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞BMP-15及其Smads信号通路影响的研究[D].石家庄：河北医科大学，2013.
[3]蔡平平.多囊卵巢综合征内皮细胞损伤及活血化瘀法对其影响[D].广州：广州中医药大学，2006.
[4]王瑞杰，李晖，孙红，等.调经助孕胶囊对着床障碍小鼠胚泡着床位点数和雌、孕激素及其受体的影响[J].中国药房， 2016， 27（19）：2629-2631.
[5]杨丽芸，杜惠兰，白静，等.补肾法、疏肝法对超促排卵小鼠卵母细胞数量及GDF-9表达的影响[J]. 中医杂志， 2013， 54（7）：597-600.
[6]阳松威，孙晓峰，贺又舜，等.左归丸对化疗致卵巢早衰小鼠卵巢功能的影响[J].中成药，2016，38（4）：717-722.
[7]康艳南，满玉晶，冷杨阳，等.卵巢早衰中西医发病机制研究[J].光明中医，2015，30（2）：358-359.
[8]包蕾，张绍芬，张月萍.卵巢功能早衰的研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2011，30（6）：479-483.
（收稿日期：2018-04-13 编辑：程鹏飞）