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摘 要：为摸清黄河三角洲地区刺参繁育特性，提高刺参育苗技术，在显微镜下观察、测量了胚胎和幼体的大小及胚胎发育过程。结果表明，在水温22±0.5 ℃，盐度（30±0.5）‰、pH 7.8条件下，利用阴干、流水刺激法可成功进行人工催产。受精卵经42 h完成胚胎发育变态为初耳状幼体，7 d左右发育为大耳状幼体，体长为760.0～970.0 μm；10 d左右生长发育为樽形幼体，16 d变态为稚参。
关键词：刺参；幼体；发育；人工繁育
刺参（Apostichopus japonicus）隶属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲 （Holothuroidea），仿刺参属（Apostichopus），是我国重要的海珍品养殖种类之一，具有很高的营养与药用价值，富含黏多糖、皂苷和凝集素等多种生理活性物质，具有提高机体免疫力、抗炎、抗肿瘤、延缓衰老等功效[1]，深受消费者喜爱。目前，我国主要养殖区集中在山东、辽宁和福建沿海[2]。在山东，随着“东参西养”的快速发展，形成了黄河三角洲地区以东营、滨州为主的刺参养殖新兴产业带，但苗种产量的不稳定性制约产业快速发展。笔者以黄河三角洲地区池塘养殖刺参为亲参，通过人工催产，开展了工厂化刺参苗种生态繁育技术研究，以期为刺参人工繁育和养殖提供基础生物学参考。
1 材料与方法
1.1 亲参的采捕与管理
北方地区每年的5月份亲参基本成熟，一般选择在4月底或5月初进行亲参的采捕与暂养。本次育苗所用亲参为2017年4月下旬采捕于滨州市无棣县池塘养殖个体，体长15～25 cm、体重250～350 g、参龄3～4年。亲参采捕后暂养于室内育苗池中，前期为自然水温、盐度；然后采用升温促熟培育亲参，在暗光条件下，日升温0.5～1 ℃，至18～20 ℃后恒温养殖，密度一般为20～30头/m3。每天投喂适量的配合饲料1次，同时进行例行管理，观察刺参活动情况。
1.2 产卵与受精
在育苗生产过程中一般采用阴干流水刺激法进行人工诱导产卵。一般雄参先排，根据雄参排精量情况，及时将雄参挑出，以避免精子过多，待亲参全部产完后，将其全部移出。视精子和卵子密度情况，判断是否进行洗卵。受精卵在育苗池中进行培育，应进行充气增氧和人工搅动，使受精卵在水体中均匀分布，以防止受精卵下沉堆积，局部缺氧，造成受精卵死亡而影响孵化。
1.3 幼体培育
幼体培育密度为0.5～1个/mL，受精卵经36～48 h发育后至初耳状幼体，消化道形成，此时可投喂饵料，前期以海洋红酵母和螺旋藻为主，每天7：30和17：30各投饵1次；后期添加鼠尾藻、配合饲料和海泥，每天投饵1次。在投饵前和投饵后对幼体进行镜检，根据其摄食情况，适当调整投饵量。当30%幼体变态成樽形幼体时，投放波纹板附着基。每天换水1次，换水量为全量的1/2。每天取样1次，观察幼体发育情况，并在光学显微镜下用目微尺测量幼体大小20个。幼体培育期间的水温、盐度变化如图1所示。
2 结果
2.1 催产与受精
亲参在室内培育15 d左右，在显微镜下检查其性腺发育情况。经检查性腺发育成熟，雄性性腺为乳白色，镜检精子活力好；雌性性腺为橘红色，镜检卵子色泽均匀，个体饱满。于5月10日采用阴干流水刺激法进行人工催产，阴干处理1.5～2 h，再流水刺激30 min，24：00时，刺参沿池壁上移至表层，活动剧烈。雄参先排精，呈白色细线状向上浮，约30 min后受刺激的雌参开始产卵，产卵量为1.5亿粒，呈橙色绒线状向下沉。随后，于5月17、18日再次产卵，产卵量分别为3亿粒、5亿粒。经镜检受精率达95%以上，同时，出现多精入卵现象。
2.2 幼体发育
受精卵一般经40～48 h发育形成初耳状幼体，此时幼体体长为410.0～530.0 μm，消化道已基本形成，胃呈椭圆形，口前环和口后环清晰可辨。幼体依靠口前环的纤毛摆动摄食，可投喂开口饵料。发育到4 d时，幼体进入中耳状幼体期，体长达550.0～750.0 μm。幼体形态和内部器官发生较大变化，胃部增大，摄食能力增加，胃部食物清晰可见。其体侧脊上的纤毛带发生弯曲和突出，前、后背臂逐渐形成。此时6对臂已清晰可辨，其中后侧臂和间背臂最为发达。同时，水体腔位于胃和食道连接处的左侧且逐渐增大。
经7 d左右发育为大耳状幼体，体长进一步增长，达到760.0～970.0 μm。此时幼体胃部两侧分别出现呈长条状的左、右两个体腔，水体腔开始向外形成初级口触手原基，最为发达的后侧臂和间背臂颜色加深，并最早出现球状体。9日龄时，幼体各臂尖端均出现球状体，口和胃部发育到幼体期的最大值，胃部呈卵圆形，颜色加深，食物在胃内不断转动。此时在水体腔上，向外长出5个小囊，似手指状分枝。
10日龄幼体进入樽形幼体初期，幼体开始收缩，幼体臂全部缩小，纤毛脱落，轮廓变得模糊。随着身体的不断收缩，纤毛带呈横向生长，形成横环纤毛带。胃部、消化道大幅收缩，与辐水管和初级口触手团缩于体腔内，且初级口触手显著变大。11日龄时，体长缩至420.4 μm，颜色变深，不易观察体内发育情况。随后，发育为五触手幼体，身体背部现刺状突起，开始形成“X”型骨片，遍布全身。幼体下沉到附着基上，依靠第一管足和触手进行爬行。刺参幼体的生长情况如图2所示。
2.3 稚参培育
当大耳状幼体有20%左右变态为樽形幼体时，投放附着基。附着基为40 cm×40 cm的聚乙烯波纹板，将波纹板放入专用的塑料框架上，每个框架放置20片，投放前需经浸泡、消毒处理。此时，稚参的附着密度一般为0.2～0.5头/cm2，投放附着基前应控制好幼体密度。每天换水1次，方式為对流，一边进水，一边排水，换水量为1/2～1个全量，随着水温的升高和稚参的生产换水量逐渐增加。在投放附着基15 d左右（幼体全部附板7～10 d）倒池1次，此后，根据水质、水温、密度等情况，5～7 d倒池1次。 3 討论
许多研究表明，精子和卵子的比例对其后续的胚胎和幼体发育具有直接影响，精子过少会使部分卵子不能受精，精子过多则会出现多精入卵现象，引起胚胎停止发育或出现非整倍体而导致胚胎的早期死亡[3-4]。因此，在刺参人工育苗过程中，需进行洗卵，大多数采用分池稀释法或沉底浓缩法，及时降低精子密度，一般精卵数量比控制在3～5∶1，以保证卵子能正常受精。
在刺参幼体发育过程中，胃部的饱满程度决定了幼体对饵料摄食和营养物质吸收，是幼体正常发育的重要因素；在大耳状幼体阶段，其水管的发育程度是决定耳状幼体变态发育为樽形幼体的重要指标。因此，在刺参人工育苗过程中，幼体胃部的饱满程度和水管的发育程度是育苗成败的关键指标。有研究表明，球状体的出现与否与幼体变态和附着密切相关[5]，投喂适量、适宜的饵料和改善育苗管理有助于提高幼体球状体的出现率。在育苗过程中，通常采用微生态制剂进行底质、水质的改善，同时合理控制培育密度；在产卵后、布附着基、倒池等阶段，及时投入抗菌药，以预防烂边病、烂胃病、滑板病等病害的发生。
参考文献：
[1] 樊绘曾.海参：海中人参-关于海参及其成分保健医疗功能的研究与开发[J].中国海洋药物，2001，20（4）：37-44.
[2] 姜森颢，任贻超，唐伯平，等.我国刺参养殖产业发展现状与对策研究[J].中国农业科技导报，2017，19（9）：15-23.
[3] 孙新明，代远玲，孙弋.体外受精过程中多精受精发生机制[J].井冈山学院学报：自然科学版， 2007， 28（6）： 76-79.
[4] Niwa K，Park C K，Okuda K. Penetration in vitro of bovine oocytes during maturation by frozen-thawed spermatozoa[J]. Journal of Reproduction and Fertility，1991，91（1）： 329-336.
[5] Dautov S.Structure and properties of hyaline spheres in holothuroid larvae[J].Invertebrate Reproduction and Development，1997，32（2）：155-161.
关键词：刺参；幼体；发育；人工繁育
刺参（Apostichopus japonicus）隶属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲 （Holothuroidea），仿刺参属（Apostichopus），是我国重要的海珍品养殖种类之一，具有很高的营养与药用价值，富含黏多糖、皂苷和凝集素等多种生理活性物质，具有提高机体免疫力、抗炎、抗肿瘤、延缓衰老等功效[1]，深受消费者喜爱。目前，我国主要养殖区集中在山东、辽宁和福建沿海[2]。在山东，随着“东参西养”的快速发展，形成了黄河三角洲地区以东营、滨州为主的刺参养殖新兴产业带，但苗种产量的不稳定性制约产业快速发展。笔者以黄河三角洲地区池塘养殖刺参为亲参，通过人工催产，开展了工厂化刺参苗种生态繁育技术研究，以期为刺参人工繁育和养殖提供基础生物学参考。
1 材料与方法
1.1 亲参的采捕与管理
北方地区每年的5月份亲参基本成熟，一般选择在4月底或5月初进行亲参的采捕与暂养。本次育苗所用亲参为2017年4月下旬采捕于滨州市无棣县池塘养殖个体，体长15～25 cm、体重250～350 g、参龄3～4年。亲参采捕后暂养于室内育苗池中，前期为自然水温、盐度；然后采用升温促熟培育亲参，在暗光条件下，日升温0.5～1 ℃，至18～20 ℃后恒温养殖，密度一般为20～30头/m3。每天投喂适量的配合饲料1次，同时进行例行管理，观察刺参活动情况。
1.2 产卵与受精
在育苗生产过程中一般采用阴干流水刺激法进行人工诱导产卵。一般雄参先排，根据雄参排精量情况，及时将雄参挑出，以避免精子过多，待亲参全部产完后，将其全部移出。视精子和卵子密度情况，判断是否进行洗卵。受精卵在育苗池中进行培育，应进行充气增氧和人工搅动，使受精卵在水体中均匀分布，以防止受精卵下沉堆积，局部缺氧，造成受精卵死亡而影响孵化。
1.3 幼体培育
幼体培育密度为0.5～1个/mL，受精卵经36～48 h发育后至初耳状幼体，消化道形成，此时可投喂饵料，前期以海洋红酵母和螺旋藻为主，每天7：30和17：30各投饵1次；后期添加鼠尾藻、配合饲料和海泥，每天投饵1次。在投饵前和投饵后对幼体进行镜检，根据其摄食情况，适当调整投饵量。当30%幼体变态成樽形幼体时，投放波纹板附着基。每天换水1次，换水量为全量的1/2。每天取样1次，观察幼体发育情况，并在光学显微镜下用目微尺测量幼体大小20个。幼体培育期间的水温、盐度变化如图1所示。
2 结果
2.1 催产与受精
亲参在室内培育15 d左右，在显微镜下检查其性腺发育情况。经检查性腺发育成熟，雄性性腺为乳白色，镜检精子活力好；雌性性腺为橘红色，镜检卵子色泽均匀，个体饱满。于5月10日采用阴干流水刺激法进行人工催产，阴干处理1.5～2 h，再流水刺激30 min，24：00时，刺参沿池壁上移至表层，活动剧烈。雄参先排精，呈白色细线状向上浮，约30 min后受刺激的雌参开始产卵，产卵量为1.5亿粒，呈橙色绒线状向下沉。随后，于5月17、18日再次产卵，产卵量分别为3亿粒、5亿粒。经镜检受精率达95%以上，同时，出现多精入卵现象。
2.2 幼体发育
受精卵一般经40～48 h发育形成初耳状幼体，此时幼体体长为410.0～530.0 μm，消化道已基本形成，胃呈椭圆形，口前环和口后环清晰可辨。幼体依靠口前环的纤毛摆动摄食，可投喂开口饵料。发育到4 d时，幼体进入中耳状幼体期，体长达550.0～750.0 μm。幼体形态和内部器官发生较大变化，胃部增大，摄食能力增加，胃部食物清晰可见。其体侧脊上的纤毛带发生弯曲和突出，前、后背臂逐渐形成。此时6对臂已清晰可辨，其中后侧臂和间背臂最为发达。同时，水体腔位于胃和食道连接处的左侧且逐渐增大。
经7 d左右发育为大耳状幼体，体长进一步增长，达到760.0～970.0 μm。此时幼体胃部两侧分别出现呈长条状的左、右两个体腔，水体腔开始向外形成初级口触手原基，最为发达的后侧臂和间背臂颜色加深，并最早出现球状体。9日龄时，幼体各臂尖端均出现球状体，口和胃部发育到幼体期的最大值，胃部呈卵圆形，颜色加深，食物在胃内不断转动。此时在水体腔上，向外长出5个小囊，似手指状分枝。
10日龄幼体进入樽形幼体初期，幼体开始收缩，幼体臂全部缩小，纤毛脱落，轮廓变得模糊。随着身体的不断收缩，纤毛带呈横向生长，形成横环纤毛带。胃部、消化道大幅收缩，与辐水管和初级口触手团缩于体腔内，且初级口触手显著变大。11日龄时，体长缩至420.4 μm，颜色变深，不易观察体内发育情况。随后，发育为五触手幼体，身体背部现刺状突起，开始形成“X”型骨片，遍布全身。幼体下沉到附着基上，依靠第一管足和触手进行爬行。刺参幼体的生长情况如图2所示。
2.3 稚参培育
当大耳状幼体有20%左右变态为樽形幼体时，投放附着基。附着基为40 cm×40 cm的聚乙烯波纹板，将波纹板放入专用的塑料框架上，每个框架放置20片，投放前需经浸泡、消毒处理。此时，稚参的附着密度一般为0.2～0.5头/cm2，投放附着基前应控制好幼体密度。每天换水1次，方式為对流，一边进水，一边排水，换水量为1/2～1个全量，随着水温的升高和稚参的生产换水量逐渐增加。在投放附着基15 d左右（幼体全部附板7～10 d）倒池1次，此后，根据水质、水温、密度等情况，5～7 d倒池1次。 3 討论
许多研究表明，精子和卵子的比例对其后续的胚胎和幼体发育具有直接影响，精子过少会使部分卵子不能受精，精子过多则会出现多精入卵现象，引起胚胎停止发育或出现非整倍体而导致胚胎的早期死亡[3-4]。因此，在刺参人工育苗过程中，需进行洗卵，大多数采用分池稀释法或沉底浓缩法，及时降低精子密度，一般精卵数量比控制在3～5∶1，以保证卵子能正常受精。
在刺参幼体发育过程中，胃部的饱满程度决定了幼体对饵料摄食和营养物质吸收，是幼体正常发育的重要因素；在大耳状幼体阶段，其水管的发育程度是决定耳状幼体变态发育为樽形幼体的重要指标。因此，在刺参人工育苗过程中，幼体胃部的饱满程度和水管的发育程度是育苗成败的关键指标。有研究表明，球状体的出现与否与幼体变态和附着密切相关[5]，投喂适量、适宜的饵料和改善育苗管理有助于提高幼体球状体的出现率。在育苗过程中，通常采用微生态制剂进行底质、水质的改善，同时合理控制培育密度；在产卵后、布附着基、倒池等阶段，及时投入抗菌药，以预防烂边病、烂胃病、滑板病等病害的发生。
参考文献：
[1] 樊绘曾.海参：海中人参-关于海参及其成分保健医疗功能的研究与开发[J].中国海洋药物，2001，20（4）：37-44.
[2] 姜森颢，任贻超，唐伯平，等.我国刺参养殖产业发展现状与对策研究[J].中国农业科技导报，2017，19（9）：15-23.
[3] 孙新明，代远玲，孙弋.体外受精过程中多精受精发生机制[J].井冈山学院学报：自然科学版， 2007， 28（6）： 76-79.
[4] Niwa K，Park C K，Okuda K. Penetration in vitro of bovine oocytes during maturation by frozen-thawed spermatozoa[J]. Journal of Reproduction and Fertility，1991，91（1）： 329-336.
[5] Dautov S.Structure and properties of hyaline spheres in holothuroid larvae[J].Invertebrate Reproduction and Development，1997，32（2）：155-161.