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摘要：羟基磷灰石是一种磷酸钙生物陶瓷， 与人体自然骨和牙齿等硬组织中的无机質在化学成分和晶体结构上具有相似性，是一类重要的骨修复材料。本文以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O为原料合成羟基磷灰石，以L-胱氨酸为表面修饰剂对羟基磷灰石进行表面修饰，将纳米银负载在其表面。通过紫外-可见分光光度法研究载银后羟基磷灰石的抑菌性，并通过X射线衍射（XRD），扫描电镜（SEM），红外光谱（FT-IR）对样品的结构与成分进行表征分析。结果显示，用氨基酸修饰后得到的羟基磷灰石颗粒呈棒状，尺寸均匀，负载纳米银前后结构没有发生变化，通过抑菌实验表明在其表面负载纳米银后，材料的抑菌性得到极大改善，从而大大提高了医学使用价值。因此，载银后的棒状羟基磷灰石在医学领域具有广阔的应用前景。
关键字： 羟基磷灰石 生物复合材料 表面修饰 抑菌性
1.前言
羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是天然骨的主要无机成分，其基本单元是羟基磷灰石晶体，长度为20-40 nm。厚度为1.5-3nm[1]。HA具有良好的生物活性和生物相容性，植入人体后能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合，是一种性能非常优良的骨修复材料[2]。临床研究证明，羟基磷灰石颗粒过松散，不能凝结成形，使用时操作极为不便，在骨创面易发生植入材料的流失，且力学性能较差，抗弯强度和断裂韧性指标均低于人体致密骨，限制了它们单独在人体负重部位的使用[3]。本文对表面修饰剂修饰后的羟基磷灰石进行研究。
2. 实验部分
2.1.羟基磷灰石复合材料的制备
（1）羟基磷灰石的制备
称取适量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例称取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例为1.67）待其完全溶解后配置一定浓度的氢氧化钠溶液调节PH=9，在磁力搅拌器上搅拌24h，烧杯口用保鲜膜密封。将上述的反应产物至于鼓风干燥箱里干燥，完全干燥后在研钵中研细，再在马弗炉中900℃煅烧45min。
（2）羟基磷灰石的表面修饰
称取适量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例称取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例为1.67）待其完全溶解后配置一定浓度的氢氧化钠溶液调节PH=9，在加入适量L-胱氨酸后充分搅拌，在磁力搅拌器上搅拌24h，烧杯口用保鲜膜密封。将上述的反应产物至于鼓风干燥箱里干燥，完全干燥后在研钵中研细，再在马弗炉中900℃煅烧45min。
（3）负载纳米银
取上述产物0.9085g溶于一定量的蒸馏水中，置于超声清洗器中超声30min，在冰浴中冷却至4℃，按5：1称取AgNO3溶于水中配成溶液加入上述溶液中;取0.1319gNaBH4溶于20ml水中（水的温度应控制在4℃），用胶头滴管缓慢将NaBH4溶液加入使其在40min内滴完。
将反应后的混合液转移至离心管中进行离心，将下层沉淀用水清洗两遍后于真空干燥箱中干燥，待完全干燥后密封保存。
3.分光光度法测抑菌性
用移液枪移取60ml的液体培养基于2个锥形瓶中，经高压灭菌锅灭菌后，用接种环取少量菌放于锥形瓶中，恒温培养一段时间，即得到二代菌液（以上操作均在无菌环境下进行）。
用移液枪分别移取40ml的液体培养基于6个锥形瓶中，编号为1、2、3、4、5、6，用报纸密封后置于高压灭菌锅灭菌。然后放到净化台中待用。
其中，将未加入药品的1、4组为对照组，将6个锥形瓶用棉塞塞紧，置于37℃的恒温振荡器中培养，每隔30min取上清液测一次OD600，在测定过程中，尽量避免培养液在空气中的暴露时间。记录实验数据，然后以OD600 为纵坐标，以时间为横坐标绘制细菌生长曲线。
4.结果与分析
4.1 红外光谱分析（FT-IR）
图1为样品的红外光谱图，如图所示，三组样品的红外光谱的波形相似，谱中主要峰的位置相同。谱线a与b在3431、1631、1084、1049、608、561 cm-1等位置出现了较强的峰，其中1631、608、561cm-1处为强而窄的峰。c曲线与其他两条不同，虽然出峰位置相同，但是在再3431cm-1处为宽而弱的峰。理论上，PO4-3有四种振动方式，分别在红外光谱中会出现四组峰，v1峰在960 cm-1附近，ν2峰位于470-440 cm-1区域，ν3位于1190-976 cm-1 区域，ν4峰位于600-560 cm-1区域[4]。因此，561、608、1049和1084 cm-1的强峰是nHA中PO4-3产生的特征峰。1631 cm?1处特征峰是H2O的振动峰，表明粉末样品表面吸附少量的水分。3431cm?1 位置的峰可能归因于样品中的-OH、-NH2、H2O等，谱线b在3431 cm-1处的峰宽而强，-NH2的特征峰理论上在1400-1420 cm?1区间，可能的原因是经过煅烧后样品表面的氨基酸没有被煅烧完全或者是氨基酸在表面转化-NH4+，但是在谱图1400-1420 cm?1区间内中没有出现峰，说明LC-HA样品中大量的氨基酸在煅烧后被除去，。谱线c中在3431 cm-1、1631 cm?1的峰与b、c相比，强度较弱，说明Ag- LC-HA中的结晶水含量较少。
4.2扫描电镜谱图分析
图2为羟基磷灰石（HAP）、用L-胱氨酸表面修饰后的羟基磷灰石LC-HA （HAP-Aa）、负载了纳米银的羟基磷灰石（Ag- LC-HA） 的扫描电镜，从图a可以看出羟基磷灰石的形貌均一，尺寸均匀。图b用L-胱氨酸表面修饰后的羟基磷灰石的形状趋向于长为40-60nm，宽为20nm的棒状，说明L-胱氨酸作为表面修饰剂修饰的效果比较好。图c为将纳米银负载在LC-HA表面，可以观察到纳米银颗粒附着在Ag-HA的表面，且分布稀疏。与图b相比，其棒状的结构没有发生变化，说明载银前后对羟基磷灰石的结构并未产生影响。 4.3 X射线衍射（XRD）
图3为羟基磷灰石（HA）、用L-胱氨酸表面修饰后的羟基磷灰石（LC-HA）、负载了纳米银的羟基磷灰石（Ag- LC-HA）的X衍射图谱。图中a、b、c谱线在2θ为25.7、32、33、47、50附近均出现衍射峰，理论上，羟基磷灰石的XRD图谱中，2θ=25.7、31.6、32.7、33.8、40、47.1、49.8、53，表示一个完整的羟基磷灰石结构[5-8]，说明三组样品中均含有羟基磷灰石晶体。a、b中谱线X射线衍射峰较弱且峰形相似，说明此时结晶程度较差，用L-胱氨酸表面修饰后样品的本身结构没有变化，表面改性只是发生在纳米材料的表面，只是表面形貌发生了变化。经查PDF卡片[8]可知，银的衍射峰大约2θ为28、34、37、43處，c中谱线较为尖锐，说明其结晶程度较好。
4.4抑菌性实验分析
图4细菌生长曲线，细菌在液体培养基中的生长呈现S形对数生长，包含四个阶段，即诱导期、对数期、稳定期、衰减期。生长曲线直观的反映了细菌的量随时间而变化的过程与规律，同时包含了许多种群生态学的信息与特征。根据生长曲线可以求出瞬时生长率，利用生长曲线的变化可以揭示药物的抑菌效果，反映微生物群体生长规律，从生长曲线可知微生物对环境的适应快慢程度、微生物对培养基成分的利用情况、药物中不同成分对微生物产生的不同作用以及药物最强与最弱的时间等多种有意义的信息。
根据图中细菌生长曲线，对羟基磷灰石表面修饰后其抑菌性能并没有变化，说明L-胱氨酸对羟基磷灰石修饰后的产物没有抑菌性能，将纳米银负载到其表面后，细菌的生长曲线趋近于直线，液体培养基中的细菌数量没有变化，说明负载了银后的样品可以作为一种新型的材料运用到医学领域。
5.结论
通过化学沉淀法，以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O为原料制备得到羟基磷灰石，添加L-胱氨酸后得到的样品在马弗炉中900℃煅烧45min后，有利于获得尺寸均匀，形状为棒状的纳米羟基磷灰石颗粒。表征后证实L-胱氨酸并不存在于样品中，说明经过热处理后L-胱氨酸被完全除去了。通过化学还原法在棒状纳米羟基磷灰石表面负载纳米银，其中以NaBH4为还原剂，AgNO3为反应前躯体得到纳米银溶胶，然后将纳米银溶胶转移到用L-胱氨酸修饰后的羟基磷灰石的表面上，载银前后羟基磷灰石的结构基本没有发生改变， Ag+部分吸附在 HA表面或进入HA晶格， 取代了Ca2+， 另一部分形成了Ag3PO4晶体。在细菌生长环境中加入负载了银的药品后，细菌生长曲线趋近于直线，表明细菌在添加了载银羟基磷灰石后的培养液中的生长被抑制，表明复合材料对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很强的抗菌性能。
参考文献
[1]毕荣荣，丁海涛，万立骏.纳米羟基磷灰石的制备及其在生物医学方面的应用[J].化学通报，2010，（4）：291-296.
[2]于方莉，周永强，张卫珂，马景云.羟基磷灰石的研究现状、制备及发展前景[J].陶瓷工业，2006（2）： 7-12.
[3]孟德营，刘金华，姜丽娜.羟基磷灰石/壳聚糖生物复合材料研究进展[J].山东轻工业学院学报（自然科学版），2009，23（1），33-37
[4]冯晋阳，吴建锋，徐晓虹.羟基磷灰石抗菌剂的研究[ J].硅酸盐通报， 2004 ，23（4）： 6 -10.
[5]Ijntema K，Heuvelsland W J，Dirix C A.Hydroxyapatite micro-carriers for biocontrolled release
of protein drugs[J].International Journal of Pharmacy，1994，112（3）：215-224.
[6]赵颜忠，朱晒红，谭娟，黄艳艳，李志友，周科朝.纳米羟基磷灰石的精氨酸表面修饰及其与基因的结合性能[J].中国有色金属学报，2010，20（6）：1203-1208.
[7]张彦杰.羟基磷灰石纳米颗粒的温和湿法合成及其微纳米分级有序结构的构筑.中国科学
院兰州化学物理研究所，2008，52-81.
[8]李轩琦，孙康宁，卢志华，李政.载银羟基磷灰石抑菌材料的研究[J].硅酸盐通
报.2008，27（1）：12-15.
关键字： 羟基磷灰石 生物复合材料 表面修饰 抑菌性
1.前言
羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是天然骨的主要无机成分，其基本单元是羟基磷灰石晶体，长度为20-40 nm。厚度为1.5-3nm[1]。HA具有良好的生物活性和生物相容性，植入人体后能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合，是一种性能非常优良的骨修复材料[2]。临床研究证明，羟基磷灰石颗粒过松散，不能凝结成形，使用时操作极为不便，在骨创面易发生植入材料的流失，且力学性能较差，抗弯强度和断裂韧性指标均低于人体致密骨，限制了它们单独在人体负重部位的使用[3]。本文对表面修饰剂修饰后的羟基磷灰石进行研究。
2. 实验部分
2.1.羟基磷灰石复合材料的制备
（1）羟基磷灰石的制备
称取适量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例称取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例为1.67）待其完全溶解后配置一定浓度的氢氧化钠溶液调节PH=9，在磁力搅拌器上搅拌24h，烧杯口用保鲜膜密封。将上述的反应产物至于鼓风干燥箱里干燥，完全干燥后在研钵中研细，再在马弗炉中900℃煅烧45min。
（2）羟基磷灰石的表面修饰
称取适量3.7435g NaH2PO2·2H2O溶于12ml水中，再取8.7645gCaCl2·2H2O加入上述溶液，（按比例称取CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O，使得Ca/P的比例为1.67）待其完全溶解后配置一定浓度的氢氧化钠溶液调节PH=9，在加入适量L-胱氨酸后充分搅拌，在磁力搅拌器上搅拌24h，烧杯口用保鲜膜密封。将上述的反应产物至于鼓风干燥箱里干燥，完全干燥后在研钵中研细，再在马弗炉中900℃煅烧45min。
（3）负载纳米银
取上述产物0.9085g溶于一定量的蒸馏水中，置于超声清洗器中超声30min，在冰浴中冷却至4℃，按5：1称取AgNO3溶于水中配成溶液加入上述溶液中;取0.1319gNaBH4溶于20ml水中（水的温度应控制在4℃），用胶头滴管缓慢将NaBH4溶液加入使其在40min内滴完。
将反应后的混合液转移至离心管中进行离心，将下层沉淀用水清洗两遍后于真空干燥箱中干燥，待完全干燥后密封保存。
3.分光光度法测抑菌性
用移液枪移取60ml的液体培养基于2个锥形瓶中，经高压灭菌锅灭菌后，用接种环取少量菌放于锥形瓶中，恒温培养一段时间，即得到二代菌液（以上操作均在无菌环境下进行）。
用移液枪分别移取40ml的液体培养基于6个锥形瓶中，编号为1、2、3、4、5、6，用报纸密封后置于高压灭菌锅灭菌。然后放到净化台中待用。
其中，将未加入药品的1、4组为对照组，将6个锥形瓶用棉塞塞紧，置于37℃的恒温振荡器中培养，每隔30min取上清液测一次OD600，在测定过程中，尽量避免培养液在空气中的暴露时间。记录实验数据，然后以OD600 为纵坐标，以时间为横坐标绘制细菌生长曲线。
4.结果与分析
4.1 红外光谱分析（FT-IR）
图1为样品的红外光谱图，如图所示，三组样品的红外光谱的波形相似，谱中主要峰的位置相同。谱线a与b在3431、1631、1084、1049、608、561 cm-1等位置出现了较强的峰，其中1631、608、561cm-1处为强而窄的峰。c曲线与其他两条不同，虽然出峰位置相同，但是在再3431cm-1处为宽而弱的峰。理论上，PO4-3有四种振动方式，分别在红外光谱中会出现四组峰，v1峰在960 cm-1附近，ν2峰位于470-440 cm-1区域，ν3位于1190-976 cm-1 区域，ν4峰位于600-560 cm-1区域[4]。因此，561、608、1049和1084 cm-1的强峰是nHA中PO4-3产生的特征峰。1631 cm?1处特征峰是H2O的振动峰，表明粉末样品表面吸附少量的水分。3431cm?1 位置的峰可能归因于样品中的-OH、-NH2、H2O等，谱线b在3431 cm-1处的峰宽而强，-NH2的特征峰理论上在1400-1420 cm?1区间，可能的原因是经过煅烧后样品表面的氨基酸没有被煅烧完全或者是氨基酸在表面转化-NH4+，但是在谱图1400-1420 cm?1区间内中没有出现峰，说明LC-HA样品中大量的氨基酸在煅烧后被除去，。谱线c中在3431 cm-1、1631 cm?1的峰与b、c相比，强度较弱，说明Ag- LC-HA中的结晶水含量较少。
4.2扫描电镜谱图分析
图2为羟基磷灰石（HAP）、用L-胱氨酸表面修饰后的羟基磷灰石LC-HA （HAP-Aa）、负载了纳米银的羟基磷灰石（Ag- LC-HA） 的扫描电镜，从图a可以看出羟基磷灰石的形貌均一，尺寸均匀。图b用L-胱氨酸表面修饰后的羟基磷灰石的形状趋向于长为40-60nm，宽为20nm的棒状，说明L-胱氨酸作为表面修饰剂修饰的效果比较好。图c为将纳米银负载在LC-HA表面，可以观察到纳米银颗粒附着在Ag-HA的表面，且分布稀疏。与图b相比，其棒状的结构没有发生变化，说明载银前后对羟基磷灰石的结构并未产生影响。 4.3 X射线衍射（XRD）
图3为羟基磷灰石（HA）、用L-胱氨酸表面修饰后的羟基磷灰石（LC-HA）、负载了纳米银的羟基磷灰石（Ag- LC-HA）的X衍射图谱。图中a、b、c谱线在2θ为25.7、32、33、47、50附近均出现衍射峰，理论上，羟基磷灰石的XRD图谱中，2θ=25.7、31.6、32.7、33.8、40、47.1、49.8、53，表示一个完整的羟基磷灰石结构[5-8]，说明三组样品中均含有羟基磷灰石晶体。a、b中谱线X射线衍射峰较弱且峰形相似，说明此时结晶程度较差，用L-胱氨酸表面修饰后样品的本身结构没有变化，表面改性只是发生在纳米材料的表面，只是表面形貌发生了变化。经查PDF卡片[8]可知，银的衍射峰大约2θ为28、34、37、43處，c中谱线较为尖锐，说明其结晶程度较好。
4.4抑菌性实验分析
图4细菌生长曲线，细菌在液体培养基中的生长呈现S形对数生长，包含四个阶段，即诱导期、对数期、稳定期、衰减期。生长曲线直观的反映了细菌的量随时间而变化的过程与规律，同时包含了许多种群生态学的信息与特征。根据生长曲线可以求出瞬时生长率，利用生长曲线的变化可以揭示药物的抑菌效果，反映微生物群体生长规律，从生长曲线可知微生物对环境的适应快慢程度、微生物对培养基成分的利用情况、药物中不同成分对微生物产生的不同作用以及药物最强与最弱的时间等多种有意义的信息。
根据图中细菌生长曲线，对羟基磷灰石表面修饰后其抑菌性能并没有变化，说明L-胱氨酸对羟基磷灰石修饰后的产物没有抑菌性能，将纳米银负载到其表面后，细菌的生长曲线趋近于直线，液体培养基中的细菌数量没有变化，说明负载了银后的样品可以作为一种新型的材料运用到医学领域。
5.结论
通过化学沉淀法，以CaCl2·2H2O、NaH2PO2·2H2O为原料制备得到羟基磷灰石，添加L-胱氨酸后得到的样品在马弗炉中900℃煅烧45min后，有利于获得尺寸均匀，形状为棒状的纳米羟基磷灰石颗粒。表征后证实L-胱氨酸并不存在于样品中，说明经过热处理后L-胱氨酸被完全除去了。通过化学还原法在棒状纳米羟基磷灰石表面负载纳米银，其中以NaBH4为还原剂，AgNO3为反应前躯体得到纳米银溶胶，然后将纳米银溶胶转移到用L-胱氨酸修饰后的羟基磷灰石的表面上，载银前后羟基磷灰石的结构基本没有发生改变， Ag+部分吸附在 HA表面或进入HA晶格， 取代了Ca2+， 另一部分形成了Ag3PO4晶体。在细菌生长环境中加入负载了银的药品后，细菌生长曲线趋近于直线，表明细菌在添加了载银羟基磷灰石后的培养液中的生长被抑制，表明复合材料对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有很强的抗菌性能。
参考文献
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[5]Ijntema K，Heuvelsland W J，Dirix C A.Hydroxyapatite micro-carriers for biocontrolled release
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[6]赵颜忠，朱晒红，谭娟，黄艳艳，李志友，周科朝.纳米羟基磷灰石的精氨酸表面修饰及其与基因的结合性能[J].中国有色金属学报，2010，20（6）：1203-1208.
[7]张彦杰.羟基磷灰石纳米颗粒的温和湿法合成及其微纳米分级有序结构的构筑.中国科学
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[8]李轩琦，孙康宁，卢志华，李政.载银羟基磷灰石抑菌材料的研究[J].硅酸盐通
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