【摘 要】
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目的 用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac(R) baculovirus expression systems,Bac-to-Bac BES)表达人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)的重组融合蛋白(fusion protein,F),并研究密码子优化、疏水性区域、SUMOStar融合标签及gp67分泌信号肽对目的 蛋白表达的影响,同时研究F蛋白的抗原性与免疫原性.方法 全基因合成HPIV-3 F蛋白昆虫细胞密码子优化基因
【机 构】
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兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃疫苗工程技术研究中心,甘肃兰州730046;兰州生物技术开发有限公司,甘肃兰州730046
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目的 用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac(R) baculovirus expression systems,Bac-to-Bac BES)表达人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3,HPIV-3)的重组融合蛋白(fusion protein,F),并研究密码子优化、疏水性区域、SUMOStar融合标签及gp67分泌信号肽对目的 蛋白表达的影响,同时研究F蛋白的抗原性与免疫原性.方法 全基因合成HPIV-3 F蛋白昆虫细胞密码子优化基因序列,设计特异性引物,经PCR扩增获得HPIV-3全长优化型F基因(op-F)、去除N端和C端疏水区域的截短优化型F基因(opt-F)和截短野生型F基因(wtt-F);将以上基因分别构建至pFastBac1、pI-SUMOStar、pI-secSUMOStar 3种载体,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对各目的 基因对应的蛋白进行表达.利用SDS-PAGE、Western blot等方法对各目的 蛋白的表达及特异性进行检测.用纯化的重组opt-F蛋白免疫青紫蓝兔,制备F蛋白特异性抗体.结果 ①对HPIV-3的opt-F基因及wtt-F基因的表达对比显示,opt-F基因在3种载体中都得到了良好表达,而wtt-F基因在3种载体中均未表达,说明密码子优化对目的 基因的表达具有重要作用;②对HPIV-3的op-F基因及opt-F基因在pFastBac1载体中的表达对比显示,opt-F基因得到了良好表达,而op-F基因未表达,说明疏水性区域可显著影响目的 基因的表达;③对HPIV-3的opt-F基因在pFastBac1及pI-SUMOStar载体中的表达对比显示,SUMOStar融合标签可使opt-F基因的表达量明显提高;④对HPIV-3的opt-F基因在pI-SUMOStar及pI-secSUMOStar载体中的表达研究显示,添加gp67分泌信号肽后未检测到opt-F基因的可溶性表达,说明gp67信号肽对目的 蛋白无促可溶性表达效果.⑤纯化的opt-F/pI-SUMOStar蛋白免疫青紫蓝兔,得到了滴度为1∶8192的抗血清.Western blot显示,此血清可以特异性结合HPIV-3病毒的F蛋白.结论 密码子优化、N/C端疏水区域的去除以及SUMOStar融合标签的嵌合,可以显著提高F蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达.
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