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摘要：叶绿素a的含量是判定湖泊营养程度的重要指标，通过对比荧光法和分光光度法对叶绿素a的测定值，表明两种方法对水质较好的湖泊水体中叶绿素a含量的测定结果无显著差异。
关键词：叶绿素a;荧光法;分光光度法;测定
叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素，其中叶绿素a存在于浮游植物中，大约占有机干重的1%～2%，是表征浮游植物生物量和水体富营养化程度的重要指标[1]。但叶绿素在自然界中不能稳定存在，遇光、氧化剂、酸碱等都易分解。通过测定水中浮游植物叶绿素a的含量，可以掌握水体的初级生产力状况以及富营养化水平，在环境监测中，叶绿素a含量是评价水体富营养化的指标之一[2]。
目前，测定叶绿素a的方法主要为荧光法[3][4]、分光光度法[5]以及高效液相色谱法[6]。荧光光度法可以现场测定叶绿素a，然而叶绿素降解产物易对光谱产生干扰从而造成误差;分光光度法测定过程简单可靠，目前是测定浮游植物叶绿素a的标准方法[4]，不过分光光度法人工提取叶绿素和测定过程较为繁琐，人员误差较大，抽滤研磨费时费力，分析人员与丙酮的接触时间长，对分析人员的身体健康有害;高效液相色谱法操作复杂，仪器设备成本高，因此不适合快速检测样品。
本文对比荧光法和分光光度法测定地表水中叶绿素a的结果进行比较，为今后相关工作提供借鉴和参考。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
天津奥特赛恩斯仪器有限公司AP-9901s型真空泵，玻璃砂芯过滤器（配500ml三角烧瓶）、玻璃研钵、冷藏干燥设备、醋酸纤维过滤膜、北京普析通用仪器有限责任公司T9型多波长紫外可见分光光度计、上海卢湘仪离心机仪器有限公司TDZ4-WS低速自动平衡离心机、10毫升离心管、10毫升容量瓶、烧杯、试管架。
Turner Designs设计生产的Trilogy实验室型荧光仪，配有叶绿素荧光模块和10x10毫米异丁烯酸酯塑料管若干。
90%丙酮溶液、1%MgCO3悬浊液。
1.2样品采集和处理
于淮南市不同湖泊表层采样，采集水样装入容积为500ml的棕色塑料瓶中，每瓶水样加入0.5ml1%MgCO3悬浊液并摇匀以防酸化所引起色素波长偏移，采样完成后使用黑色塑料袋包裹遮光。按照规范分别由分光光度法和荧光法对每个样品测量三次，取其均值。
1.3实验方法
1.3.1分光光度法
将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。
ρ=[11.85×（A664-A750）-1.54×（A647-A750）-0.08×（A630-A750）]×V1/V
式中，ρ是叶绿素a含量，mg/m3;V是水样体积（L），A是吸光值，V1是提取液定容后的体积（ml）。
1.3.2荧光法
检查Trilogy实验室型荧光仪连接，连好后开机，选择叶绿素荧光模块，调取标准曲线后取待测样品于管中，放入模块测量，待示数稳定后读取数值。
2结果和讨论
下表l显示了分辨采用分光光度法和荧光法对淮南市6个不同湖泊水体中叶绿素a的含量进行测定，剔除由于误差产生的异常测定值，计算各湖泊的三个平行样测定结果的平均值。
从表1可以看出，在淮南市不同湖泊水体的6个叶绿素a测定值中，叶绿素a的分光光度法分析结果普遍高于荧光分析结果（（1#～5#点位），实际样品分析时，测得6#点位的浊度高于其他位点，此时叶绿素a的测定结果为分光光度法分析结果低于荧光分析结果。根据赵洋甬等[7]在研究浊度对荧光法测定叶绿素a的影响时得出的结论，浊度可以增加水体中叶绿素a含量测定值，其增加量与浊度呈现正相关。其原因是水体中含有大量悬浮物或颗粒物，会对激发光和产生的荧光发生强烈的反射和散射作用，从而增加了测定的本底值，造成测定结果相对偏高。
去除6#点位测定值，采用T检验对分光光度法和荧光法测定1#～5#点位叶绿素a含量的数值进行分析比较，结果表明两种方法测得的数值无显著差异（P>0.05）。分析分光光度法测定湖泊水体中叶绿素a含量结果高于荧光法测定的结果，主要原因是分光光度法操作步骤中可以充分破碎藻类细胞壁，对叶绿素a的提取效率高[8];同时本次测定1#～5#点位的湖泊水体叶绿素a含量较低，水体相对洁净，抽滤待测定水样时不易堵塞滤膜，可以抽取较多体积的水样（根据湖泊水体营养状态，水样过滤体积范围在100～1000ml），从而对叶绿素a的测定结果产生了一定影响。
3结论
本文比较了分光光度法法和荧光法测定地表水中叶绿素a的结果，结果表明，分光光度法与荧光法测定水质较好的地表水中叶绿素a的结果没有显著差异。当水质较差，水体浊度较高时，荧光法测定叶绿素a含量与浊度存在相关性，测定误差增大。
采用荧光法可现场对地表水中叶绿素a含量进行测定，与实验室分光光度法相比，分析过程相对简单便捷、短时间即可获取测定结果。随着经济的快速发展，对于湖泊水体的环境保护力度在不断加强，叶绿素a作为评价湖库富营养化水平的重要指标，其检测方法也日益受到相关部门和科研机构的高度重视，荧光法以其在叶绿素a测定中便捷性和实时性，结合湖库营养状态评价的其他指标，可以快速判断湖庫营养状态，为水环境管理和科研工作提供即时的数据支撑。
参考文献
[1]金相灿，屠清瑛.湖泊富营养化调查规范[M].北京：中国环境科学出版社.1990，268-270
[2]童桂凤，陈志芳，范莹.分光光度法测定叶绿素a的比较[J].环境监测管理与技术，2012，21（1）：53-55.
[3]张丽，郭翠莲，张述伟，等.荧光法测定叶绿素a的影响因素及其数据校正[J].山东科学，2017，30（3）：8-11，16.
[4]吕鹏翼.荧光法测定水体中叶绿素的影响因素研究[D].石家庄：河北科技大学，2014
[5]环境保护部HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法[S].北京：中国环境科学出版社.2017
[6]戴荣继，佟斌，黄春，等.HPLC测定饮用水中藻类叶绿素含量[J].北京理工大学学报，2006，26（1）：87-89
[7]赵洋甬，沈碧君，胡建林，等.浊度对荧光法测定叶绿素a的影响[C].中国环境科学学会学术年会论文集.北京：[s.n]，2013
[8]黄昌妙，叶树才，王潮，等.浮游植物叶绿素a测定方法的比较分析[J].福建分析测试，2013，22（4）：23-27
作者简介
王粟（1983-），男，汉族籍贯：安徽临泉，职称：工程师，学历：安徽大学生态学，硕士研究生单位：淮南市环境保护监测站，研究方向：环境监测。
关键词：叶绿素a;荧光法;分光光度法;测定
叶绿素是植物光合作用中的重要光合色素，其中叶绿素a存在于浮游植物中，大约占有机干重的1%～2%，是表征浮游植物生物量和水体富营养化程度的重要指标[1]。但叶绿素在自然界中不能稳定存在，遇光、氧化剂、酸碱等都易分解。通过测定水中浮游植物叶绿素a的含量，可以掌握水体的初级生产力状况以及富营养化水平，在环境监测中，叶绿素a含量是评价水体富营养化的指标之一[2]。
目前，测定叶绿素a的方法主要为荧光法[3][4]、分光光度法[5]以及高效液相色谱法[6]。荧光光度法可以现场测定叶绿素a，然而叶绿素降解产物易对光谱产生干扰从而造成误差;分光光度法测定过程简单可靠，目前是测定浮游植物叶绿素a的标准方法[4]，不过分光光度法人工提取叶绿素和测定过程较为繁琐，人员误差较大，抽滤研磨费时费力，分析人员与丙酮的接触时间长，对分析人员的身体健康有害;高效液相色谱法操作复杂，仪器设备成本高，因此不适合快速检测样品。
本文对比荧光法和分光光度法测定地表水中叶绿素a的结果进行比较，为今后相关工作提供借鉴和参考。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
天津奥特赛恩斯仪器有限公司AP-9901s型真空泵，玻璃砂芯过滤器（配500ml三角烧瓶）、玻璃研钵、冷藏干燥设备、醋酸纤维过滤膜、北京普析通用仪器有限责任公司T9型多波长紫外可见分光光度计、上海卢湘仪离心机仪器有限公司TDZ4-WS低速自动平衡离心机、10毫升离心管、10毫升容量瓶、烧杯、试管架。
Turner Designs设计生产的Trilogy实验室型荧光仪，配有叶绿素荧光模块和10x10毫米异丁烯酸酯塑料管若干。
90%丙酮溶液、1%MgCO3悬浊液。
1.2样品采集和处理
于淮南市不同湖泊表层采样，采集水样装入容积为500ml的棕色塑料瓶中，每瓶水样加入0.5ml1%MgCO3悬浊液并摇匀以防酸化所引起色素波长偏移，采样完成后使用黑色塑料袋包裹遮光。按照规范分别由分光光度法和荧光法对每个样品测量三次，取其均值。
1.3实验方法
1.3.1分光光度法
将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。
ρ=[11.85×（A664-A750）-1.54×（A647-A750）-0.08×（A630-A750）]×V1/V
式中，ρ是叶绿素a含量，mg/m3;V是水样体积（L），A是吸光值，V1是提取液定容后的体积（ml）。
1.3.2荧光法
检查Trilogy实验室型荧光仪连接，连好后开机，选择叶绿素荧光模块，调取标准曲线后取待测样品于管中，放入模块测量，待示数稳定后读取数值。
2结果和讨论
下表l显示了分辨采用分光光度法和荧光法对淮南市6个不同湖泊水体中叶绿素a的含量进行测定，剔除由于误差产生的异常测定值，计算各湖泊的三个平行样测定结果的平均值。
从表1可以看出，在淮南市不同湖泊水体的6个叶绿素a测定值中，叶绿素a的分光光度法分析结果普遍高于荧光分析结果（（1#～5#点位），实际样品分析时，测得6#点位的浊度高于其他位点，此时叶绿素a的测定结果为分光光度法分析结果低于荧光分析结果。根据赵洋甬等[7]在研究浊度对荧光法测定叶绿素a的影响时得出的结论，浊度可以增加水体中叶绿素a含量测定值，其增加量与浊度呈现正相关。其原因是水体中含有大量悬浮物或颗粒物，会对激发光和产生的荧光发生强烈的反射和散射作用，从而增加了测定的本底值，造成测定结果相对偏高。
去除6#点位测定值，采用T检验对分光光度法和荧光法测定1#～5#点位叶绿素a含量的数值进行分析比较，结果表明两种方法测得的数值无显著差异（P>0.05）。分析分光光度法测定湖泊水体中叶绿素a含量结果高于荧光法测定的结果，主要原因是分光光度法操作步骤中可以充分破碎藻类细胞壁，对叶绿素a的提取效率高[8];同时本次测定1#～5#点位的湖泊水体叶绿素a含量较低，水体相对洁净，抽滤待测定水样时不易堵塞滤膜，可以抽取较多体积的水样（根据湖泊水体营养状态，水样过滤体积范围在100～1000ml），从而对叶绿素a的测定结果产生了一定影响。
3结论
本文比较了分光光度法法和荧光法测定地表水中叶绿素a的结果，结果表明，分光光度法与荧光法测定水质较好的地表水中叶绿素a的结果没有显著差异。当水质较差，水体浊度较高时，荧光法测定叶绿素a含量与浊度存在相关性，测定误差增大。
采用荧光法可现场对地表水中叶绿素a含量进行测定，与实验室分光光度法相比，分析过程相对简单便捷、短时间即可获取测定结果。随着经济的快速发展，对于湖泊水体的环境保护力度在不断加强，叶绿素a作为评价湖库富营养化水平的重要指标，其检测方法也日益受到相关部门和科研机构的高度重视，荧光法以其在叶绿素a测定中便捷性和实时性，结合湖库营养状态评价的其他指标，可以快速判断湖庫营养状态，为水环境管理和科研工作提供即时的数据支撑。
参考文献
[1]金相灿，屠清瑛.湖泊富营养化调查规范[M].北京：中国环境科学出版社.1990，268-270
[2]童桂凤，陈志芳，范莹.分光光度法测定叶绿素a的比较[J].环境监测管理与技术，2012，21（1）：53-55.
[3]张丽，郭翠莲，张述伟，等.荧光法测定叶绿素a的影响因素及其数据校正[J].山东科学，2017，30（3）：8-11，16.
[4]吕鹏翼.荧光法测定水体中叶绿素的影响因素研究[D].石家庄：河北科技大学，2014
[5]环境保护部HJ 897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法[S].北京：中国环境科学出版社.2017
[6]戴荣继，佟斌，黄春，等.HPLC测定饮用水中藻类叶绿素含量[J].北京理工大学学报，2006，26（1）：87-89
[7]赵洋甬，沈碧君，胡建林，等.浊度对荧光法测定叶绿素a的影响[C].中国环境科学学会学术年会论文集.北京：[s.n]，2013
[8]黄昌妙，叶树才，王潮，等.浮游植物叶绿素a测定方法的比较分析[J].福建分析测试，2013，22（4）：23-27
作者简介
王粟（1983-），男，汉族籍贯：安徽临泉，职称：工程师，学历：安徽大学生态学，硕士研究生单位：淮南市环境保护监测站，研究方向：环境监测。