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关键词：贵州黑山羊;BMP15;SNPs;生物信息学
骨形态发生蛋白15（BMP15）又称生长分化因子9B，不仅能够促进颗粒细胞分裂、分化，而且能够抑制颗粒细胞中FSHR基因的表达[1]，同时能够促进卵泡发育[6-7]。BMP15基因由1个内含子与2个外显子构成，2个外显子被内含子隔开，外显子全长1 176 bp，共编码393个氨基酸残基的前蛋白。通过大量研究发现，BMP15基因可能与高繁殖性状有关，研究人员已在国内优良地方品种的绵羊上对BMP15基因展开相关研究，以期为构建高繁殖力群体奠定基础。目前，已在少数绵羊品种上发现BMP15基因与繁殖性状有关联，在小尾寒羊上发现BMP15基因B2处突变对高繁殖性状影响作用十分明显[4-5]。程俐芬等人研究发现BMP15基因在第一外显子中虽存在突变位点，但对绵羊繁殖性状并没有显著影响[3]。吴翠玲等研究6个绵羊群体发现，BMP15基因外显子1上在58～60 bp处有3个碱基（CTT）缺失[1]。本研究通过PCR产物直接测序技术并结合生物软件对贵州黑山羊BMP15基因进行多态性研究与生物信息学分析，预测mRNA二级结构、蛋白质二级结构、三级结构，以期为今后研究贵州黑山羊繁殖性状提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 血液DNA提取
102只贵州黑山羊血液样本，来自册亨县冗渡镇贵州领头羊山地草牧业科技有限公司。血液DNA提取采用天根血液基因组DNA提取试剂盒，提取后用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行检测，检测结果发现条带清晰明亮、无RNA和蛋白质等污染。通过微量紫外分光光度计检测DNA质量D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之间，说明DNA提取效果好，纯度高。
1.2 引物设计与合成
根据NCBI数据库中绵羊BMP15基因序列（登录号：NM_001114767.1）利用Primer 5.0软件设计2对引物，其目的片段覆盖全部外显子区域，引物序列见表1。引物合成由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
1.3 PCR扩增
贵州黑山羊基因组DNA采用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20.0 μL：PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA2.0 μL，蒸馏水5.0 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，退火（退火温度见表1）30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR扩增产物用1%;琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 PCR扩增产物测序和基因序列分析
PCR扩增产物，送往上海英潍捷基贸易有限公司进行双向测序。测序结果利用SeqMan软件进行序列分析，采用MWSnap测量SNPs等位基因的峰高值，根据Ai=Bi/（Ba Bb），i=a，b公式估算各等位基因频率。利用生物信息学软件进行mRNA二级结构预测，蛋白质二级、三级结构预测。
2 结果与分析
2.1 DNA检测结果
采用1%的琼脂糖凝胶电泳对血液DNA进行检测，电泳结果显示基因组条带整齐、清晰明亮、无RNA和蛋白质等污染，并利用紫外分光光度计测量D260 nm/280 nm均在1.8～2.0范围内。检测DNA结果表明提取的DNA可用于PCR扩增。
2.2 PCR扩增产物检测结果
以5 μL扩增产物为样本用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，以1 000 bp DNA Ladder Maker作为分子量标记对照。检测结果见图1，PCR扩增产物条带整齐、清晰明亮、检测片段长度与目的片段一致，其扩增目的片段长度分别为632 bp和920 bp，表明2对引物的特异性较好。
2.3 扩增基因的测序
测序结果利用SeqMan软件查看，找到1个SNP位点，由图2可知，在第二外显子6 260 bp处发生C→G突变，exon2-C 6 260 bp，利用DNAStar中的EditSeq软件进行分析发现，BMP15基因编码的蛋白质突变前后发生改变，由Gln突变为Glu，第二外显子上的突变为错义突变。
2.4 SNPs等位基因频率估算
BMP15基因SNPs等位基因的峰高值利用MWSnap软件进行测量，将其测量值代入公式，利用公式估算出突变前后等位基因频率，突变前为0.485，突变后为0.515，数据结果显示突变前后有差异。
2.5 BMP15基因mRNA二级结构分析
利用EditSeq软件进行mRNA二级结构分析发现，BMP15基因mRNA的序列在突变前后翻译的氨基酸序列不同，使得mRNA结构改变。利用http：//rna.tbi.univie.ac.at-bin/RNAfold.cgi软件进行mRNA二级结构预测，发现其突变前后的自由能均为-1 201.75 kJ/mol，突变前后具体的二级结构见图3。
2.6 BMP15的蛋白质理化特性分析
依照BMP15基因所编码的氨基酸序列，通过http：//us.expasy.org/tools/protparam.html在线进行蛋白质理化特性分析。由表3可知，BMP15基因分子式突变前为C1828H2779N515O494S14，突变后为C1828H2778N514O495S14，在酵母菌中的半衰期突变前后均大于3 min，在人体外红细胞中半衰期突变前后均大于2.8 h，该蛋白属于不稳定性蛋白。利用Antheprot 63分析软件对BMP15蛋白的亲水性和易溶性进行分析，由图4、图5可知，BMP15蛋白的亲水指数范围为-1.91～2.72;易溶性较强，皆为正数，最大易溶性为3.97。综上分析，BMP15蛋白整体上表现为亲水性。利用在线跨膜蛋白数据库对BMP15的跨膜区域进行分析，由图6可知，实线表示跨膜方向由膜内向膜外，虚线表示跨膜方向膜外向膜内，2种跨膜方向皆是由正数到负数再到正数的顺序，此蛋白具有跨膜结构。 2.7 BMP15蛋白质二级结构分析
https：//npsa-pr-abi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_Sopma.html网页在线进行蛋白质二级结构预测;结果显示，α-螺旋（Alpha helix）、β-转角（Beta turn）、扩展链、 无规卷曲在突变位点前后均有改变（表4）。利用Protean软件对BMP15蛋白质二级结构进行预测（图7）。
2.8 BMP15蛋白质三级结构分析
http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index网页在线进行蛋白质三级结构预测，分析显示突变前和突变后的变化具体结构，见图8。
3 讨论
近年，研究人员不断地挖掘BMP15基因突变位点[8-9]，并且有研究发现BMP15基因是控制绵羊高繁殖性状的主效基因之一[10-11]，目前已在Inverdale绵羊、Hanna绵羊和Lacaune绵羊等国外品种中发现BMP15基因与产羔性状相关的多个不同突变位点[15]。田志龙等人在绵羊上对BMP15基因进行多态性研究，发现g.50971423T
骨形态发生蛋白15（BMP15）又称生长分化因子9B，不仅能够促进颗粒细胞分裂、分化，而且能够抑制颗粒细胞中FSHR基因的表达[1]，同时能够促进卵泡发育[6-7]。BMP15基因由1个内含子与2个外显子构成，2个外显子被内含子隔开，外显子全长1 176 bp，共编码393个氨基酸残基的前蛋白。通过大量研究发现，BMP15基因可能与高繁殖性状有关，研究人员已在国内优良地方品种的绵羊上对BMP15基因展开相关研究，以期为构建高繁殖力群体奠定基础。目前，已在少数绵羊品种上发现BMP15基因与繁殖性状有关联，在小尾寒羊上发现BMP15基因B2处突变对高繁殖性状影响作用十分明显[4-5]。程俐芬等人研究发现BMP15基因在第一外显子中虽存在突变位点，但对绵羊繁殖性状并没有显著影响[3]。吴翠玲等研究6个绵羊群体发现，BMP15基因外显子1上在58～60 bp处有3个碱基（CTT）缺失[1]。本研究通过PCR产物直接测序技术并结合生物软件对贵州黑山羊BMP15基因进行多态性研究与生物信息学分析，预测mRNA二级结构、蛋白质二级结构、三级结构，以期为今后研究贵州黑山羊繁殖性状提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 血液DNA提取
102只贵州黑山羊血液样本，来自册亨县冗渡镇贵州领头羊山地草牧业科技有限公司。血液DNA提取采用天根血液基因组DNA提取试剂盒，提取后用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA进行检测，检测结果发现条带清晰明亮、无RNA和蛋白质等污染。通过微量紫外分光光度计检测DNA质量D260 nm/D280 nm均在1.8～2.0之间，说明DNA提取效果好，纯度高。
1.2 引物设计与合成
根据NCBI数据库中绵羊BMP15基因序列（登录号：NM_001114767.1）利用Primer 5.0软件设计2对引物，其目的片段覆盖全部外显子区域，引物序列见表1。引物合成由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
1.3 PCR扩增
贵州黑山羊基因组DNA采用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20.0 μL：PCR Mixture 10.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA2.0 μL，蒸馏水5.0 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，退火（退火温度见表1）30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循环;72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR扩增产物用1%;琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4 PCR扩增产物测序和基因序列分析
PCR扩增产物，送往上海英潍捷基贸易有限公司进行双向测序。测序结果利用SeqMan软件进行序列分析，采用MWSnap测量SNPs等位基因的峰高值，根据Ai=Bi/（Ba Bb），i=a，b公式估算各等位基因频率。利用生物信息学软件进行mRNA二级结构预测，蛋白质二级、三级结构预测。
2 结果与分析
2.1 DNA检测结果
采用1%的琼脂糖凝胶电泳对血液DNA进行检测，电泳结果显示基因组条带整齐、清晰明亮、无RNA和蛋白质等污染，并利用紫外分光光度计测量D260 nm/280 nm均在1.8～2.0范围内。检测DNA结果表明提取的DNA可用于PCR扩增。
2.2 PCR扩增产物检测结果
以5 μL扩增产物为样本用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，以1 000 bp DNA Ladder Maker作为分子量标记对照。检测结果见图1，PCR扩增产物条带整齐、清晰明亮、检测片段长度与目的片段一致，其扩增目的片段长度分别为632 bp和920 bp，表明2对引物的特异性较好。
2.3 扩增基因的测序
测序结果利用SeqMan软件查看，找到1个SNP位点，由图2可知，在第二外显子6 260 bp处发生C→G突变，exon2-C 6 260 bp，利用DNAStar中的EditSeq软件进行分析发现，BMP15基因编码的蛋白质突变前后发生改变，由Gln突变为Glu，第二外显子上的突变为错义突变。
2.4 SNPs等位基因频率估算
BMP15基因SNPs等位基因的峰高值利用MWSnap软件进行测量，将其测量值代入公式，利用公式估算出突变前后等位基因频率，突变前为0.485，突变后为0.515，数据结果显示突变前后有差异。
2.5 BMP15基因mRNA二级结构分析
利用EditSeq软件进行mRNA二级结构分析发现，BMP15基因mRNA的序列在突变前后翻译的氨基酸序列不同，使得mRNA结构改变。利用http：//rna.tbi.univie.ac.at-bin/RNAfold.cgi软件进行mRNA二级结构预测，发现其突变前后的自由能均为-1 201.75 kJ/mol，突变前后具体的二级结构见图3。
2.6 BMP15的蛋白质理化特性分析
依照BMP15基因所编码的氨基酸序列，通过http：//us.expasy.org/tools/protparam.html在线进行蛋白质理化特性分析。由表3可知，BMP15基因分子式突变前为C1828H2779N515O494S14，突变后为C1828H2778N514O495S14，在酵母菌中的半衰期突变前后均大于3 min，在人体外红细胞中半衰期突变前后均大于2.8 h，该蛋白属于不稳定性蛋白。利用Antheprot 63分析软件对BMP15蛋白的亲水性和易溶性进行分析，由图4、图5可知，BMP15蛋白的亲水指数范围为-1.91～2.72;易溶性较强，皆为正数，最大易溶性为3.97。综上分析，BMP15蛋白整体上表现为亲水性。利用在线跨膜蛋白数据库对BMP15的跨膜区域进行分析，由图6可知，实线表示跨膜方向由膜内向膜外，虚线表示跨膜方向膜外向膜内，2种跨膜方向皆是由正数到负数再到正数的顺序，此蛋白具有跨膜结构。 2.7 BMP15蛋白质二级结构分析
https：//npsa-pr-abi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_Sopma.html网页在线进行蛋白质二级结构预测;结果显示，α-螺旋（Alpha helix）、β-转角（Beta turn）、扩展链、 无规卷曲在突变位点前后均有改变（表4）。利用Protean软件对BMP15蛋白质二级结构进行预测（图7）。
2.8 BMP15蛋白质三级结构分析
http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index网页在线进行蛋白质三级结构预测，分析显示突变前和突变后的变化具体结构，见图8。
3 讨论
近年，研究人员不断地挖掘BMP15基因突变位点[8-9]，并且有研究发现BMP15基因是控制绵羊高繁殖性状的主效基因之一[10-11]，目前已在Inverdale绵羊、Hanna绵羊和Lacaune绵羊等国外品种中发现BMP15基因与产羔性状相关的多个不同突变位点[15]。田志龙等人在绵羊上对BMP15基因进行多态性研究，发现g.50971423T