Toll样受体4激活对转化生长因子-β1致骨骼肌纤维化作用的影响

来源 :中华实验外科杂志 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dengscc
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目的

提取并培养小鼠骨骼肌内肌源性干细胞(MDSCs),观察其在Toll样受体4(TLR4)激活后,对转化生长因子-β1(TGF-β1)介导的骨骼肌纤维化作用的影响。

方法

细胞培养:采用差速贴壁法获得小鼠肌源性干细胞,传代培养。所得细胞分为3组,A组作为阴性对照,B组在培养液中加入重组人TGF-β1(rhTGF-β1),C组加入重组人TGF-β1和TLR-4激动剂热休克蛋白60(Hsp60)。上述各组细胞培养3 d后,分别行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、免疫荧光染色。检测各组细胞核因子(NF)-κB表达差异,明确B组细胞TLR-4是否被激活,再通过比较各组MDSCs在TLR-4激活后结缔组织生长因子(CTGF)和Ⅰ型胶原的表达水平。动物实验:取雄性小鼠24只(体重15~18 g),随机分为D、E、F 3组(每组8只)。每周一分别于左侧腓肠肌内侧头注射生理盐水(阴性对照)、rhTGF-β1、rhTGF-β1加Hsp60混合溶液,连续4周。第28天切取左侧腓肠肌内侧头测量肌湿重,Von Geison染色比较肌肉组织纤维化程度。

结果

细胞培养:RT-PCR测定A、B、C 3组所得核转录因子κB(NF-κB)相对表达量分别为:0.852±0.121、0.987±0.084、1.304±0.171(P=0.031)。CTGF相对表达量分别为:0.756±0.205、0.977±0.188、1.308±0.302(P=0.022)。Ⅰ型胶原相对表达量分别为:0.767±0.148、0.998±0.138、1.261±0.327(P=0.016)。Western blot测定A、B、C 3组NF-κB与内参的吸光度比值依次为:0.784±0.133、0.887±0.066、0.994±0.171(P=0.026)。CTGF与内参的吸光度比值依次为:0.644±0.125、0.863±0.109、0.998±0.512(P=0.018)。Ⅰ型胶原与内参的吸光度比值依次为:0.347±0.133、0.761±0.086、0.868±0.167(P=0.045)。与Western blot结果相对应,免疫荧光染色结果显示在A、B、C 3组CTGF和Ⅰ型胶原的表达依次增强,差异有统计学意义(P=0.025,P=0.012)。动物实验:D、E、F3组测得腓肠肌内侧头湿重值分别为(0.015±0.002)、(0.014±0.002)、(0.012±0.003) g,3组所测值依次降低,差异有统计学意义(P=0.037)。PD vs. E=0.033, PD vs. F=0.029, PE vs. F=0.016。D、E、F 3组Von Geison染色测得腓肠肌胶原纤维累积光密度比值分别为100.8±10.3、112.7±11.1、131.9±12.5。3组所测值依次升高,总体差异有统计学意义(P=0.013,PD vs. E=0.041, PD vs. F=0.027, PE vs. F=0.010)。

结论

小鼠骨骼肌肌源性干细胞表面TLR-4激活可促进TGF-β1介导的骨骼肌纤维化进程。

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