论文部分内容阅读
摘 要：文章以采自四川凉山州的脾寒草为原料，通过不同工艺对脾寒草生物活性成分进行提取，探究脾寒草生物活性成分，并对其活性成分进行定性与定量研究，以为脾寒草资源的综合开发利用提供理论依据。研究的主要内容与结果如下：①采用外标法，通过HPLC对脾寒草粗提物进行初步定性，结果表明，组分Ⅰ为桃叶珊瑚苷。②以桃叶珊瑚苷提取率为最终的考量指标，探讨提取工艺对生物活性成分提取的影响。实验结论是，最佳方法是酶辅助提取法，工艺条件为乙醇浓度80%、料液比1∶10（g∶ml）、提取温度40℃、酶法提取时间为60min，总桃叶珊瑚苷提取量可达3.654mg/g。
关键词：脾寒草；桃叶珊瑚苷；抗氧化活性；高效液相色
脾寒草学名直立婆婆纳（Veronica arvensis L.），玄参科婆婆纳属植物，全体具细软毛，茎直立，或下部略偃伏，高10～30cm，一年或二年生草本，原产中国西藏、云南西北部，在四川省凉山州境内也有分布，在民间医疗中，其被选作伤风流感引起的头疼发热治疗药物，亦用作日常饮品，保健用。而有关脾寒草的研究报道极少，据相关文献研究，直立婆婆纳同属的许多种类，全草药用，具有多种药效。《中国药植图鉴》中写到脾寒草主治疟疾，而在凉山州民间，彝族医药里也用作为补品，用以养肝护肝。近几年，国内外学者对婆婆纳属植物的药理学研究报道不断增多，发现其在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗微生物等方面均有良好的活性。根据赵一等人的研究，用直立婆婆纳的干全草制成流浸膏，初步确证有抗疟作用。近几年国内外学者对婆婆纳属植物的药理学研究报道不断增多，对婆婆纳属植物的生物活性成分的探究越来越广泛和深入，但就脾寒草的生物活性成分研究仍然存在大量的空白。因此，开展脾寒草的理论研究，可以填补其研究空白，为其开发利用提供依据。
国内对婆婆纳属植物的化学成分研究主要是对轮叶婆婆纳、长果婆婆纳、毛果婆婆纳的研究，针对婆婆纳属药用植物的化学成分研究报道主要集中在苯乙醇苷类化合物，环烯醚萜苷类化合物，黄酮类化合物以及有机酸。有关植物活性成分提取的工艺主要回流提取、超声波提取、酶辅助提取。回流提取以乙醇和甲醇作为提取环烯醚萜苷类物质最常用的两种有机溶剂，最后将提取液进行过滤、浓缩；超声波辅助提取法是对环烯醚萜苷类物质进行提取的另一种新型的提取法，其利用超声波对环烯醚萜苷类物质进行提取，原理是超声波具有空化、粉碎和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，加速溶剂的运动，使溶剂更容易渗透到细胞中，从而让环烯醚萜苷类物质溶于提取溶液中，最后分离出活性成分；酶辅助提取法是指在提取环烯醚萜苷类物质的过程中，向其中加入活性酶，引起细胞中相关底物发生转糖反应和酶解反应，提高环烯醚萜苷类物质得率的新兴技术。
通过查阅脾寒草同属种植物的研究资料，结合崔红梅、张仁波、田亮、张彦文、高坤等人的研究报道表明其活性成分主要有：黄酮类物质（丹参酮Ⅰ（Ⅶ））、隐丹参酮（Ⅳ）、二氢丹参酮Ⅰ（Ⅵ）、1，2-去氢隐丹参酮（Ⅰ）、丹参酮ⅡA（Ⅷ），有机酸类物质（3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、3，4-二甲氧基苯甲酸3，4-二甲氧基桂皮酸、3-O-乙酰齐墩果酸、异阿魏酸和3-羟基-4-甲氧基苯甲酸），苯乙醇苷类（胡萝卜苷Ⅱ、D-甘露醇、β-谷甾醇），环烯醚萜苷类（6-Overatroylcatalposide、6-Oisovanilloylcatalpole、catalposide、verproside、amphicoside，桃叶珊瑚苷）。因此推测脾寒草中含有的活性成分可能有黄酮类、苯乙醇苷类、有机酸、环烯醚萜苷类。
根据Chang，H-Moo等人对肝损伤治疗药物的研究，发现婆婆纳属的多種植物，普遍存在桃叶珊瑚苷，据此推测脾寒草生物活性成分中可能含有桃叶珊瑚苷。桃叶珊瑚苷（aucubin，AU），化学名为β-D-吡喃葡萄糖苷，是一种植物的次生代谢产物，是一种环烯醚萜苷类化合物。它能够有效地促进干细胞再生，并且能够明显地抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，桃叶珊瑚苷的苷元及其有效多聚体是一种抗菌素。桃叶珊瑚苷具有保肝、护肝、降压、利小便、镇痛、清湿热、抗肿瘤等多种活性成分。桃叶珊瑚苷是某些成药的质量指标，又是传统中药杜仲、车前草、地黄的主要活性成分。
关于桃叶珊瑚苷的生物活性报道较多，由于桃叶珊瑚苷极性大，分子小极性大，所以可以用乙醇、甲醇、水等极性溶剂进行提取，但是提取的温度、时间、方法等对提取效率依旧有明显影响。药物的药用活性成分除了药物本身的性质决定，还与其不同的提取工艺有关，介于对其脾寒草的生物活性成分的提取和分析的研究空白，参照其他中药材的提取工艺流程，选择了三种提取工艺对其生物活性成分进行提取和分析。对比不同工艺条件下桃叶珊瑚苷等生物活性成分含量以及成分分析，并对比不同提取产物的抗氧化活性，探究脾寒草的生物活性成分，弥补脾寒草的研究空白，选择合理的提取工艺，为脾寒草的研究提供理论依据。
一、材料与方法
1.试验材料
实验所用药材为彝族药材脾寒草，于2017年采集于四川省凉山州，整株用于药用，部分从当地民间诊所直接购买，在实验中心阴干备用。
2.主要试剂
主要有桃叶珊瑚苷标准品（色谱纯，叮当时代医药科技有限公司），甲醇（分析纯），乙腈（色谱纯），DPPH（分析纯），纤维素酶（化夏试剂有限公司），果胶酶（上海瑞勇生物科技有限公司）。
3.主要仪器设备
主要有超声波清洗机（洁康超声波清洗机PS-D40A），岛津高效液相色谱仪（岛津LC3000，单元泵LC-20AT，检测器SPD-20A，柱温箱CTO-10AS，自动进样器SIL-20A），干燥箱（GZX-DH202-1-BS-II，上海贺德实验设备有限公司），电子天平（FA2004分析电子天平，上海良平仪器仪表有限公司）。
4.实验方法
（1）提取方法。超声波提取法：精密称定取脾寒草药材粉末1g（过三号筛），加入10%乙醇10mL，称定总的质量，利用超声处理60min（功率250W，温度40℃），冷却至室温；用10%乙醇补足减失的质量，混合均匀后，利用布氏漏斗过滤，得100mg/ml的脾寒草供试品溶液。 （2）抗氧化性检测方法。DPPH自由基清除力测定原理是，DPPH在有机溶剂中呈紫色，且在517nm处有较大吸收，当加入抗氧化剂一部分自由基被清除掉，使该波长被吸收，通过吸光值的大小来判断物质的抗氧化活性高低。
参照唐建波等分析刺梨多糖抗氧化性的测定方法，采用DPPH自由基清除作用测定脾寒草供试品的抗氧化性。量取100mg/ml的供试品溶液2ml，加水定容至10ml，配成质量浓度为20mg/ml样品，再以该质量浓度稀释成所需的浓度。于棕色容量瓶中，以无水乙醇作为溶剂配制0.16mmol/LDPPH溶液。
取3mlDPPH溶液，等体积加入待测样品稀释液，25℃水浴15min后，517nm波长下测得试样吸光度（Ai），以蒸馏水代替样品测得空白吸光度（Ao），以无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度（Aj），以抗坏血酸作阳性对照，按下式计算清除率： K（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。
（3）高效液相色谱检测。脾寒草提取溶液首先进行紫外分光光度法，进行全波长扫描确定最大吸峰值，其次进行高效液相检测，采用外标法，对脾寒草供试品进行高效液相色谱分析，称取桃叶珊瑚苷对照品5mg，置于25mL棕色量瓶中，加入无水乙醇24ml，冷却后，用无水乙醇定容，得到0.2mg/mL桃叶珊瑚苷对照品储备溶液，药品用过0.45?m微孔滤膜，4℃保存待用。
液相色谱条件，参照标准∶流动相为乙腈∶水（5∶95），检测波长为190nm；结合崔红梅等分析毛果婆婆纳中桃叶珊瑚苷的方法，采用流动相为乙腈∶水（5∶95），流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长210nm，350nm，进样量体积设置为20μL。
二、结果与分析
1.抗氧化活性分析
本研究测定了100mg/ml的脾寒草供试品的DPPH自由基清除能力，脾寒草供试品对DPPH自由基清除作用的半清除浓度IC50为3.2531mg/ml，表明脾寒草供试品有良好的抗氧化活性。随着脾寒草提取液的浓度上升，抗氧化活性急剧上升，当质量浓度达到10mg/ml时清除率就达到了79.65%。
2.脾寒草供试品高效液相色谱分析
（1）检测波长选择。脾寒草供试品溶液全波长（190～700nm），扫描结果是，在190nm处对照品桃叶珊瑚苷有最大吸收，经光谱等高线分析优化检测条件，选择210nm，350nm为检测波长，杂质干扰更少。
（2）高效液相色谱分析。为进一步验证，采用高效液相色谱对桃叶珊瑚苷标准品进行定性分析，其结果显示，组分桃叶珊瑚苷出峰时间为4.501min，脾寒草供试品经高效液相色谱洗脱的结果，再在相同的高效液相色谱条件下进行定性分析，通过组分保留时间的对比，可以看出相同高效液相色谱条件下，组分Ⅰ保留时间为4.461，这与主峰的出峰时间基本一致，因此，初步判定组分Ⅰ为桃叶珊瑚苷。
3.不同工艺样品高效液相色谱检测结果
将制备的九种样品溶液按上述色谱条件进样分析，进样量20μL，记录色谱图，外标法计算桃叶珊瑚苷的质量分数，结果如下：
脾寒草桃叶珊瑚苷的含量与提取率如下表：
参考文献：
[1]田 亮，周金云.婆婆纳属植物的研究進展[J].中药材，2004（1）.
[2]张仁波，窦全丽.国内婆婆纳属药用植物研究进展[J].科技资讯，2009（31）.
关键词：脾寒草；桃叶珊瑚苷；抗氧化活性；高效液相色
脾寒草学名直立婆婆纳（Veronica arvensis L.），玄参科婆婆纳属植物，全体具细软毛，茎直立，或下部略偃伏，高10～30cm，一年或二年生草本，原产中国西藏、云南西北部，在四川省凉山州境内也有分布，在民间医疗中，其被选作伤风流感引起的头疼发热治疗药物，亦用作日常饮品，保健用。而有关脾寒草的研究报道极少，据相关文献研究，直立婆婆纳同属的许多种类，全草药用，具有多种药效。《中国药植图鉴》中写到脾寒草主治疟疾，而在凉山州民间，彝族医药里也用作为补品，用以养肝护肝。近几年，国内外学者对婆婆纳属植物的药理学研究报道不断增多，发现其在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗微生物等方面均有良好的活性。根据赵一等人的研究，用直立婆婆纳的干全草制成流浸膏，初步确证有抗疟作用。近几年国内外学者对婆婆纳属植物的药理学研究报道不断增多，对婆婆纳属植物的生物活性成分的探究越来越广泛和深入，但就脾寒草的生物活性成分研究仍然存在大量的空白。因此，开展脾寒草的理论研究，可以填补其研究空白，为其开发利用提供依据。
国内对婆婆纳属植物的化学成分研究主要是对轮叶婆婆纳、长果婆婆纳、毛果婆婆纳的研究，针对婆婆纳属药用植物的化学成分研究报道主要集中在苯乙醇苷类化合物，环烯醚萜苷类化合物，黄酮类化合物以及有机酸。有关植物活性成分提取的工艺主要回流提取、超声波提取、酶辅助提取。回流提取以乙醇和甲醇作为提取环烯醚萜苷类物质最常用的两种有机溶剂，最后将提取液进行过滤、浓缩；超声波辅助提取法是对环烯醚萜苷类物质进行提取的另一种新型的提取法，其利用超声波对环烯醚萜苷类物质进行提取，原理是超声波具有空化、粉碎和搅拌作用，破坏植物药材的细胞，加速溶剂的运动，使溶剂更容易渗透到细胞中，从而让环烯醚萜苷类物质溶于提取溶液中，最后分离出活性成分；酶辅助提取法是指在提取环烯醚萜苷类物质的过程中，向其中加入活性酶，引起细胞中相关底物发生转糖反应和酶解反应，提高环烯醚萜苷类物质得率的新兴技术。
通过查阅脾寒草同属种植物的研究资料，结合崔红梅、张仁波、田亮、张彦文、高坤等人的研究报道表明其活性成分主要有：黄酮类物质（丹参酮Ⅰ（Ⅶ））、隐丹参酮（Ⅳ）、二氢丹参酮Ⅰ（Ⅵ）、1，2-去氢隐丹参酮（Ⅰ）、丹参酮ⅡA（Ⅷ），有机酸类物质（3-甲氧基-4-羟基苯甲酸、3，4-二甲氧基苯甲酸3，4-二甲氧基桂皮酸、3-O-乙酰齐墩果酸、异阿魏酸和3-羟基-4-甲氧基苯甲酸），苯乙醇苷类（胡萝卜苷Ⅱ、D-甘露醇、β-谷甾醇），环烯醚萜苷类（6-Overatroylcatalposide、6-Oisovanilloylcatalpole、catalposide、verproside、amphicoside，桃叶珊瑚苷）。因此推测脾寒草中含有的活性成分可能有黄酮类、苯乙醇苷类、有机酸、环烯醚萜苷类。
根据Chang，H-Moo等人对肝损伤治疗药物的研究，发现婆婆纳属的多種植物，普遍存在桃叶珊瑚苷，据此推测脾寒草生物活性成分中可能含有桃叶珊瑚苷。桃叶珊瑚苷（aucubin，AU），化学名为β-D-吡喃葡萄糖苷，是一种植物的次生代谢产物，是一种环烯醚萜苷类化合物。它能够有效地促进干细胞再生，并且能够明显地抑制乙型肝炎病毒DNA的复制，桃叶珊瑚苷的苷元及其有效多聚体是一种抗菌素。桃叶珊瑚苷具有保肝、护肝、降压、利小便、镇痛、清湿热、抗肿瘤等多种活性成分。桃叶珊瑚苷是某些成药的质量指标，又是传统中药杜仲、车前草、地黄的主要活性成分。
关于桃叶珊瑚苷的生物活性报道较多，由于桃叶珊瑚苷极性大，分子小极性大，所以可以用乙醇、甲醇、水等极性溶剂进行提取，但是提取的温度、时间、方法等对提取效率依旧有明显影响。药物的药用活性成分除了药物本身的性质决定，还与其不同的提取工艺有关，介于对其脾寒草的生物活性成分的提取和分析的研究空白，参照其他中药材的提取工艺流程，选择了三种提取工艺对其生物活性成分进行提取和分析。对比不同工艺条件下桃叶珊瑚苷等生物活性成分含量以及成分分析，并对比不同提取产物的抗氧化活性，探究脾寒草的生物活性成分，弥补脾寒草的研究空白，选择合理的提取工艺，为脾寒草的研究提供理论依据。
一、材料与方法
1.试验材料
实验所用药材为彝族药材脾寒草，于2017年采集于四川省凉山州，整株用于药用，部分从当地民间诊所直接购买，在实验中心阴干备用。
2.主要试剂
主要有桃叶珊瑚苷标准品（色谱纯，叮当时代医药科技有限公司），甲醇（分析纯），乙腈（色谱纯），DPPH（分析纯），纤维素酶（化夏试剂有限公司），果胶酶（上海瑞勇生物科技有限公司）。
3.主要仪器设备
主要有超声波清洗机（洁康超声波清洗机PS-D40A），岛津高效液相色谱仪（岛津LC3000，单元泵LC-20AT，检测器SPD-20A，柱温箱CTO-10AS，自动进样器SIL-20A），干燥箱（GZX-DH202-1-BS-II，上海贺德实验设备有限公司），电子天平（FA2004分析电子天平，上海良平仪器仪表有限公司）。
4.实验方法
（1）提取方法。超声波提取法：精密称定取脾寒草药材粉末1g（过三号筛），加入10%乙醇10mL，称定总的质量，利用超声处理60min（功率250W，温度40℃），冷却至室温；用10%乙醇补足减失的质量，混合均匀后，利用布氏漏斗过滤，得100mg/ml的脾寒草供试品溶液。 （2）抗氧化性检测方法。DPPH自由基清除力测定原理是，DPPH在有机溶剂中呈紫色，且在517nm处有较大吸收，当加入抗氧化剂一部分自由基被清除掉，使该波长被吸收，通过吸光值的大小来判断物质的抗氧化活性高低。
参照唐建波等分析刺梨多糖抗氧化性的测定方法，采用DPPH自由基清除作用测定脾寒草供试品的抗氧化性。量取100mg/ml的供试品溶液2ml，加水定容至10ml，配成质量浓度为20mg/ml样品，再以该质量浓度稀释成所需的浓度。于棕色容量瓶中，以无水乙醇作为溶剂配制0.16mmol/LDPPH溶液。
取3mlDPPH溶液，等体积加入待测样品稀释液，25℃水浴15min后，517nm波长下测得试样吸光度（Ai），以蒸馏水代替样品测得空白吸光度（Ao），以无水乙醇代替DPPH溶液测得样品本底吸光度（Aj），以抗坏血酸作阳性对照，按下式计算清除率： K（%）=[Ao-（Ai-Aj）]/Ao×100。
（3）高效液相色谱检测。脾寒草提取溶液首先进行紫外分光光度法，进行全波长扫描确定最大吸峰值，其次进行高效液相检测，采用外标法，对脾寒草供试品进行高效液相色谱分析，称取桃叶珊瑚苷对照品5mg，置于25mL棕色量瓶中，加入无水乙醇24ml，冷却后，用无水乙醇定容，得到0.2mg/mL桃叶珊瑚苷对照品储备溶液，药品用过0.45?m微孔滤膜，4℃保存待用。
液相色谱条件，参照标准∶流动相为乙腈∶水（5∶95），检测波长为190nm；结合崔红梅等分析毛果婆婆纳中桃叶珊瑚苷的方法，采用流动相为乙腈∶水（5∶95），流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长210nm，350nm，进样量体积设置为20μL。
二、结果与分析
1.抗氧化活性分析
本研究测定了100mg/ml的脾寒草供试品的DPPH自由基清除能力，脾寒草供试品对DPPH自由基清除作用的半清除浓度IC50为3.2531mg/ml，表明脾寒草供试品有良好的抗氧化活性。随着脾寒草提取液的浓度上升，抗氧化活性急剧上升，当质量浓度达到10mg/ml时清除率就达到了79.65%。
2.脾寒草供试品高效液相色谱分析
（1）检测波长选择。脾寒草供试品溶液全波长（190～700nm），扫描结果是，在190nm处对照品桃叶珊瑚苷有最大吸收，经光谱等高线分析优化检测条件，选择210nm，350nm为检测波长，杂质干扰更少。
（2）高效液相色谱分析。为进一步验证，采用高效液相色谱对桃叶珊瑚苷标准品进行定性分析，其结果显示，组分桃叶珊瑚苷出峰时间为4.501min，脾寒草供试品经高效液相色谱洗脱的结果，再在相同的高效液相色谱条件下进行定性分析，通过组分保留时间的对比，可以看出相同高效液相色谱条件下，组分Ⅰ保留时间为4.461，这与主峰的出峰时间基本一致，因此，初步判定组分Ⅰ为桃叶珊瑚苷。
3.不同工艺样品高效液相色谱检测结果
将制备的九种样品溶液按上述色谱条件进样分析，进样量20μL，记录色谱图，外标法计算桃叶珊瑚苷的质量分数，结果如下：
脾寒草桃叶珊瑚苷的含量与提取率如下表：
参考文献：
[1]田 亮，周金云.婆婆纳属植物的研究進展[J].中药材，2004（1）.
[2]张仁波，窦全丽.国内婆婆纳属药用植物研究进展[J].科技资讯，2009（31）.