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摘要：利用平板显色法，从腐烂的水果中筛选出1株能够转化甘油产生甘油酸的菌株。根据生理生化、形态学鉴定以及16S rDNA基因序列结果的分析，确定该菌株的生物学分类地位。该菌株属于醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus），将其命名为HD1025。初步发酵试验表明，该菌株能够以 150 g/L 甘油为底物生产49.47 g/L的甘油酸。
关键词：甘油酸；甘油；生理生化；醋酸杆菌；平板显色法
中图分类号： S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）04-0224-03
甘油酸（2，3-二羟基丙酸）存在于自然界各种各样的植物中，它作为一种中间代谢物同样也存在于人体内。甘油酸及甘油酸的衍生物具有很多生物学功能：在人体内D-甘油酸能使胃部细胞在一定剂量乙醇刺激后增强活力从而促进乙醇分解代谢，因此它可以作为解酒药成分[1]；据报道，在狗体内的甘油酸具有胆固醇活性和肝兴奋剂的功能，甘油酸衍生的酯类低聚物能表现出抗胰蛋白酶活性[2]。同时，甘油酸由于自身生物可降解性优于其他的一些高聚物，可用作药物的运输载体。在食品方面，甘油酸同样具有很多用途。
甘油酸的生产方法有化学法和生物法2种，目前市场上销售的甘油酸大部分是通过化学方法生产而来的，化学方法与生物法相比，具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点。利用微生物发酵法生产甘油酸，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此被广泛关注。但是，目前国外关于生产甘油酸菌株的报道较少，1987年日本报道泰国葡萄糖酸杆菌Gluconobacter thailandicus NBRC 3172、氧化葡萄糖酸杆菌G. oxydans NBRC 3292、氧化葡萄糖酸杆菌G. oxydans NBRC 3294、弗拉托葡萄糖酸杆菌G. frateurii NBRC 3262生产甘油酸产量分别为27.2、36.0、32.6、57.2 g/L[3-5]。Sato等报道利用热带醋酸杆菌Acetobacter tropicalis NBRC 16470、弗拉托葡萄糖酸杆菌G. frateurii NBRC 103465等菌株生产甘油酸，其中部分菌株产量可达100 g/L以上[6]。然而，到目前为止国内还未见有关甘油酸发酵方面的报道。
本研究在国内首次报道从腐烂的水果中筛选到1株能够利用甘油发酵生产甘油酸的菌株，并对其进行形态学、生理生化鉴定以及16S rDNA基因序列分析，确定它属于醋酸杆菌科葡萄糖酸杆菌属，将其命名为HD1025。
1材料与方法
1.1菌株与培养基
1.1.1菌株
日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus） HD1025由笔者所在实验室从腐烂的水果中分离获得。
1.1.2培养基
平板筛选培养基：甘油15%、蛋白胨 0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、溴甲酚紫0.05%、琼脂2%，pH值6.5～7.0。
斜面保藏培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、瓊脂2%，pH值6.5～7.0。
种子培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值6.5～7.0。
发酵培养基：甘油15%、蛋白胨0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 2%，pH值6.5～7.0。
上述培养基中种子培养基和斜面培养基是在115 ℃下灭菌30 min，筛选培养基和发酵培养基在121 ℃下灭菌30 min。每个试验做3个重复，取平均值并计算误差。
发酵罐培养条件：400 r/min，装液量为3 L，通气量为 1 L/（L·min），30 ℃。
1.2菌株的分离与筛选
在河南省开封市区内取样，样品包括污水、淤泥、腐烂的水果和蔬菜、地表土样、蜂蜜等。将取得的样品粉碎，取10 g样品加入到90 mL无菌水中，在摇床中振荡1 h。取菌悬浮液，稀释成一系列浓度梯度。取10-5、10-6、10-7等3个梯度0.2 mL悬浮液涂布于平板筛选培养基上，30 ℃培养3～4 d。挑取菌落周围培养基颜色由紫色变成黄色的菌株，分别接种于斜面培养基和发酵罐发酵培养基进行初筛，220 r/min、[JP 1]30 ℃，好氧培养72 h。取72 h后的发酵液，测定甘油酸含量。选取初筛产量较高的菌株接种在发酵培养基进行复筛，培养条件和初筛相同。取72 h发酵液测定甘油酸和残留的甘油含量。选取甘油酸高产菌株进行斜面保存，进行下步试验。[JP]
1.3分析测定
采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）测定发酵液中甘油酸、甘油含量[7-8]。
检测条件：1515泵、2489紫外检测器（检测波长 210 nm）、2414示差检测器、1500柱温箱、2707自动进样器。色谱柱型号：Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）；柱温60 ℃；流动相为5 mmol/L H2SO4、20%乙腈；流速0.3 mL/min；进样量20 μL。
1.4菌种鉴定
1.4.1细胞形态特征
菌落形态观察：取试管斜面上的菌体平板划线制备单菌落，挑取单菌落接在种子培养基上，30 ℃摇瓶好氧培养24 h，取种子培养液梯度稀释至合适倍数后，将稀释液涂布于平板培养基上，30 ℃培养4 d得到单菌落，观察菌落外形及特征。 扫描电镜观察：取试管斜面上的菌体平板划线制备单菌落，挑取单菌落样品制成菌悬液然后制片，制作方法如下：（1）将菌液在6 000 r/min下离心6 min后，用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次；（2）将菌体经火焰固定于盖玻片上；（3）将盖玻片置于盛有2.5%戊二醛溶液的染盆中，固定1.5 h；（4）取出盖玻片用乙醇（30%、50%、70%、90%、100%，依次脱水15 min；（5）喷金仪中喷金；（6）扫描电镜观察及拍照。
1.4.2生理生化特征鉴定
根据《伯杰氏手册》《常见细菌系统鉴定手册》，选取几种特征性生理生化项目进行鉴定[9-10]。
1.4.316S rDNA基因序列分析
委托宝生物工程（大连）有限公司进行DNA测序；在NCBI网站上用BLAST检索 GenBank 中相关菌株的16S rDNA基因序列，下载同源性最高的序列，用BioEdit 7.0软件编辑后再使用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，确定该菌的分类地位。
1.5遗传稳定性试验
采用群体传代的方法，传接10代后，检测摇瓶发酵液中甘油酸的含量，与第1代相比，观察菌株发酵性能的变化，确定遗传稳定性，是否适用于工业生产。
2结果与分析
2.1甘油酸产生菌株的分离和筛选
按照“1.2”节的方法采集样品分离纯化菌株，根据“1.3”节的检测方法，检测发酵液中甘油酸的含量。初步分离共得到25株能够氧化甘油产生甘油酸形态各异的菌株，不同菌株形成的变色圈大小不同，初步表明它们产酸能力的大小，再利用摇瓶发酵对25株菌株进行复筛。检测发酵液中产物甘油酸、副产物二羟基丙酮和剩余底物甘油的含量。在腐烂的水果中筛选出1株产量较高的菌株，其产量初步发酵达到2203 g/L，将其命名为HD1025。
2.2培养特征和形态观察[HT]
按照“1.4.1”节的方法，将菌悬液涂布于筛选培养基上，30 ℃培养4～5 d，菌落的培养特征：菌落较小，湿润，圆形，不透明，白色，直径可达0.5～1.0 cm（图1）。扫描电镜观察细胞形态特征：细胞呈短圆杆状，无鞭毛，不运动。
2.3生理生化鉴定
由表1中HD1025菌株的生理生化试验结果可见：革兰氏染色、接触酶、氧化酶、还原硝酸盐、液化明胶、产吲哚、氧化乙醇到乙酸、氧化乙酸盐生成长CO2和H2O、多醇类生酮、水解淀粉、D-木糖产酸、D-葡萄糖产酸等属间特征生理生化反应结果鉴定该菌株属于葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter），根据形成5-酮基葡萄糖酸、[JP 1]甘油产甘油酸、利用D-阿拉伯糖醇生长、利用赤藓糖醇生长等种间生理生化特性鉴定该菌株与弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）存在一定的区别，与日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）类似[11-14]。[JP]
2.4基因序列分析及其系统发育分析
经过对HD1025的16S rDNA基因测序，获得1 398 bp长度的基因序列，将该序列提交GenBank（登记号为KT964237），对相关数据进行相似性分析，然后采用BioEdit 7.0软件编辑后再使用MEGA 4.0软件構建进化树分析。由图3可知，HD1025与日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）（相似度100%）和弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）（相似度99.86%）的亲缘关系较近，然而试验表明，HD1025与弗拉托葡萄糖酸杆菌菌株在部分生理生化试验上仍有不同，而与日本葡萄糖酸杆菌亲缘关系最接近。因而，最终将该菌种确定为日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus），拟将该菌株命名为2.6菌株G. japonicus HD1025发酵罐发酵曲线
在“1.1.2”节给出的条件将菌株HD1025发酵72 h，甘油酸产量达到49.47 g/L，残余底物含量为 92.22 g/L（图4）。
3讨论
目前，国外关于微生物法生产甘油酸报道较多的是弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）、弱氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter suboxydans）、氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）等菌株，其中弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）[CM（18]菌株产甘油酸的能力较强，但在生产甘油
酸的过程中会受到底物甘油的抑制。到目前为止，国内外尚未有利用日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）菌株进行甘油酸生产的报道。
本试验从腐烂水果中筛选出1株能够氧化甘油生产甘油酸的菌株。经形态学鉴定、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析，将该菌株命名为日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）。该菌株可以耐高浓度甘油，在150 g/L的初始甘油浓度下生长良好。该菌株分批发酵72 h可产甘油酸 49.47 g/L，预计经菌种选育及发酵工艺优化后甘油酸的产量会有较大的提升，具有很好的工业化应用价值。
参考文献：
[1]卢英华，陈慧敏，蒲洋，等. 一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法：CN104263689A[P]. 2015-01-07.
[2]Habe H，Fukuoka T，Kitamoto D，et al. Biotechnological production of D-glyceric acid and its application[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（3）：445-452.
关键词：甘油酸；甘油；生理生化；醋酸杆菌；平板显色法
中图分类号： S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）04-0224-03
甘油酸（2，3-二羟基丙酸）存在于自然界各种各样的植物中，它作为一种中间代谢物同样也存在于人体内。甘油酸及甘油酸的衍生物具有很多生物学功能：在人体内D-甘油酸能使胃部细胞在一定剂量乙醇刺激后增强活力从而促进乙醇分解代谢，因此它可以作为解酒药成分[1]；据报道，在狗体内的甘油酸具有胆固醇活性和肝兴奋剂的功能，甘油酸衍生的酯类低聚物能表现出抗胰蛋白酶活性[2]。同时，甘油酸由于自身生物可降解性优于其他的一些高聚物，可用作药物的运输载体。在食品方面，甘油酸同样具有很多用途。
甘油酸的生产方法有化学法和生物法2种，目前市场上销售的甘油酸大部分是通过化学方法生产而来的，化学方法与生物法相比，具有成本高、耗能大、产量低并且不具有立体选择性等缺点。利用微生物发酵法生产甘油酸，环境温和、产量高、方法简便而且产物具有立体选择性，因此被广泛关注。但是，目前国外关于生产甘油酸菌株的报道较少，1987年日本报道泰国葡萄糖酸杆菌Gluconobacter thailandicus NBRC 3172、氧化葡萄糖酸杆菌G. oxydans NBRC 3292、氧化葡萄糖酸杆菌G. oxydans NBRC 3294、弗拉托葡萄糖酸杆菌G. frateurii NBRC 3262生产甘油酸产量分别为27.2、36.0、32.6、57.2 g/L[3-5]。Sato等报道利用热带醋酸杆菌Acetobacter tropicalis NBRC 16470、弗拉托葡萄糖酸杆菌G. frateurii NBRC 103465等菌株生产甘油酸，其中部分菌株产量可达100 g/L以上[6]。然而，到目前为止国内还未见有关甘油酸发酵方面的报道。
本研究在国内首次报道从腐烂的水果中筛选到1株能够利用甘油发酵生产甘油酸的菌株，并对其进行形态学、生理生化鉴定以及16S rDNA基因序列分析，确定它属于醋酸杆菌科葡萄糖酸杆菌属，将其命名为HD1025。
1材料与方法
1.1菌株与培养基
1.1.1菌株
日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus） HD1025由笔者所在实验室从腐烂的水果中分离获得。
1.1.2培养基
平板筛选培养基：甘油15%、蛋白胨 0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、溴甲酚紫0.05%、琼脂2%，pH值6.5～7.0。
斜面保藏培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、MgSO4·7H2O 0.1%、瓊脂2%，pH值6.5～7.0。
种子培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母粉05%、MgSO4·7H2O 0.1%，pH值6.5～7.0。
发酵培养基：甘油15%、蛋白胨0.9%、酵母粉0.1%、K2HPO4 0.01%、KH2PO4 0.09%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 2%，pH值6.5～7.0。
上述培养基中种子培养基和斜面培养基是在115 ℃下灭菌30 min，筛选培养基和发酵培养基在121 ℃下灭菌30 min。每个试验做3个重复，取平均值并计算误差。
发酵罐培养条件：400 r/min，装液量为3 L，通气量为 1 L/（L·min），30 ℃。
1.2菌株的分离与筛选
在河南省开封市区内取样，样品包括污水、淤泥、腐烂的水果和蔬菜、地表土样、蜂蜜等。将取得的样品粉碎，取10 g样品加入到90 mL无菌水中，在摇床中振荡1 h。取菌悬浮液，稀释成一系列浓度梯度。取10-5、10-6、10-7等3个梯度0.2 mL悬浮液涂布于平板筛选培养基上，30 ℃培养3～4 d。挑取菌落周围培养基颜色由紫色变成黄色的菌株，分别接种于斜面培养基和发酵罐发酵培养基进行初筛，220 r/min、[JP 1]30 ℃，好氧培养72 h。取72 h后的发酵液，测定甘油酸含量。选取初筛产量较高的菌株接种在发酵培养基进行复筛，培养条件和初筛相同。取72 h发酵液测定甘油酸和残留的甘油含量。选取甘油酸高产菌株进行斜面保存，进行下步试验。[JP]
1.3分析测定
采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，简称HPLC）测定发酵液中甘油酸、甘油含量[7-8]。
检测条件：1515泵、2489紫外检测器（检测波长 210 nm）、2414示差检测器、1500柱温箱、2707自动进样器。色谱柱型号：Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm，9 μm）；柱温60 ℃；流动相为5 mmol/L H2SO4、20%乙腈；流速0.3 mL/min；进样量20 μL。
1.4菌种鉴定
1.4.1细胞形态特征
菌落形态观察：取试管斜面上的菌体平板划线制备单菌落，挑取单菌落接在种子培养基上，30 ℃摇瓶好氧培养24 h，取种子培养液梯度稀释至合适倍数后，将稀释液涂布于平板培养基上，30 ℃培养4 d得到单菌落，观察菌落外形及特征。 扫描电镜观察：取试管斜面上的菌体平板划线制备单菌落，挑取单菌落样品制成菌悬液然后制片，制作方法如下：（1）将菌液在6 000 r/min下离心6 min后，用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液清洗3次；（2）将菌体经火焰固定于盖玻片上；（3）将盖玻片置于盛有2.5%戊二醛溶液的染盆中，固定1.5 h；（4）取出盖玻片用乙醇（30%、50%、70%、90%、100%，依次脱水15 min；（5）喷金仪中喷金；（6）扫描电镜观察及拍照。
1.4.2生理生化特征鉴定
根据《伯杰氏手册》《常见细菌系统鉴定手册》，选取几种特征性生理生化项目进行鉴定[9-10]。
1.4.316S rDNA基因序列分析
委托宝生物工程（大连）有限公司进行DNA测序；在NCBI网站上用BLAST检索 GenBank 中相关菌株的16S rDNA基因序列，下载同源性最高的序列，用BioEdit 7.0软件编辑后再使用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，确定该菌的分类地位。
1.5遗传稳定性试验
采用群体传代的方法，传接10代后，检测摇瓶发酵液中甘油酸的含量，与第1代相比，观察菌株发酵性能的变化，确定遗传稳定性，是否适用于工业生产。
2结果与分析
2.1甘油酸产生菌株的分离和筛选
按照“1.2”节的方法采集样品分离纯化菌株，根据“1.3”节的检测方法，检测发酵液中甘油酸的含量。初步分离共得到25株能够氧化甘油产生甘油酸形态各异的菌株，不同菌株形成的变色圈大小不同，初步表明它们产酸能力的大小，再利用摇瓶发酵对25株菌株进行复筛。检测发酵液中产物甘油酸、副产物二羟基丙酮和剩余底物甘油的含量。在腐烂的水果中筛选出1株产量较高的菌株，其产量初步发酵达到2203 g/L，将其命名为HD1025。
2.2培养特征和形态观察[HT]
按照“1.4.1”节的方法，将菌悬液涂布于筛选培养基上，30 ℃培养4～5 d，菌落的培养特征：菌落较小，湿润，圆形，不透明，白色，直径可达0.5～1.0 cm（图1）。扫描电镜观察细胞形态特征：细胞呈短圆杆状，无鞭毛，不运动。
2.3生理生化鉴定
由表1中HD1025菌株的生理生化试验结果可见：革兰氏染色、接触酶、氧化酶、还原硝酸盐、液化明胶、产吲哚、氧化乙醇到乙酸、氧化乙酸盐生成长CO2和H2O、多醇类生酮、水解淀粉、D-木糖产酸、D-葡萄糖产酸等属间特征生理生化反应结果鉴定该菌株属于葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter），根据形成5-酮基葡萄糖酸、[JP 1]甘油产甘油酸、利用D-阿拉伯糖醇生长、利用赤藓糖醇生长等种间生理生化特性鉴定该菌株与弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）存在一定的区别，与日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）类似[11-14]。[JP]
2.4基因序列分析及其系统发育分析
经过对HD1025的16S rDNA基因测序，获得1 398 bp长度的基因序列，将该序列提交GenBank（登记号为KT964237），对相关数据进行相似性分析，然后采用BioEdit 7.0软件编辑后再使用MEGA 4.0软件構建进化树分析。由图3可知，HD1025与日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）（相似度100%）和弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）（相似度99.86%）的亲缘关系较近，然而试验表明，HD1025与弗拉托葡萄糖酸杆菌菌株在部分生理生化试验上仍有不同，而与日本葡萄糖酸杆菌亲缘关系最接近。因而，最终将该菌种确定为日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus），拟将该菌株命名为2.6菌株G. japonicus HD1025发酵罐发酵曲线
在“1.1.2”节给出的条件将菌株HD1025发酵72 h，甘油酸产量达到49.47 g/L，残余底物含量为 92.22 g/L（图4）。
3讨论
目前，国外关于微生物法生产甘油酸报道较多的是弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）、弱氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter suboxydans）、氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）等菌株，其中弗拉托葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter frateurii）[CM（18]菌株产甘油酸的能力较强，但在生产甘油
酸的过程中会受到底物甘油的抑制。到目前为止，国内外尚未有利用日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）菌株进行甘油酸生产的报道。
本试验从腐烂水果中筛选出1株能够氧化甘油生产甘油酸的菌株。经形态学鉴定、生理生化试验和16S rDNA基因序列分析，将该菌株命名为日本葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter japonicus）。该菌株可以耐高浓度甘油，在150 g/L的初始甘油浓度下生长良好。该菌株分批发酵72 h可产甘油酸 49.47 g/L，预计经菌种选育及发酵工艺优化后甘油酸的产量会有较大的提升，具有很好的工业化应用价值。
参考文献：
[1]卢英华，陈慧敏，蒲洋，等. 一种用于生产甘油酸的热带醋杆菌的驯化方法：CN104263689A[P]. 2015-01-07.
[2]Habe H，Fukuoka T，Kitamoto D，et al. Biotechnological production of D-glyceric acid and its application[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84（3）：445-452.