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摘要：建立了超声萃取—阳离子交换高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺含量的方法。乳制品经1%三氯乙酸乙腈溶液超声萃取15分钟后，经强阳离子交换型色谱柱进行分离，采用二极管阵列检测器检测。流动相为50 mmol磷酸盐（pH=2.5）：乙腈（35：65），检测波长为235nm，三聚氰胺的线性范围为0.5—400μg/g，线性方程的相关系数大于0.99，加标回收率在93%—110%之间，相对标准偏差均小于9.1%。三聚氰胺的检测限为0.02μg/g。本方法简单、快速，可有效消除乳制品基体干扰，测定结果满意，可应用于乳制品中三聚氰胺的监控。
关键词：超声萃取；三聚氰胺；乳制品；阳离子交换色谱
中图分类号：TB 文献标识码：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2016.06.092
1引言
由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量。宠物饲料及婴幼儿奶粉中非法添加三聚氰胺，造成对健康的危害。三聚氰胺的检测颇受关注。目前对三聚氰胺的检测主要局限于饲料类产品，多用离子对色谱法，虽然国家已出台了三聚氰胺的检测标准，前处理采用固相萃取技术，存在费时费力，有机溶剂使用量较大的缺点。国外关于三聚氰胺的分析方法主要是色谱法，如HPLC，GC/MS和LC/MS/MS，也有用拉曼光谱进行检测的报道，但均未见乳制品中三聚氰胺检测的报道。乳制品含有脂肪、蛋白质，若前处理不好，低含量的三聚氰胺的检测易受干扰。超声萃取是一种有效的前处理方法，萃取溶剂的选择对超声萃取效果影响极大。针对目前乳制品中三聚氰胺的检测样品量大，建立简单、快速、可靠的乳制品中三聚氰胺的分析方法非常必要。
本文采用1%三氯乙酸乙腈溶液为提取液的超声萃取为前处理方法，以二极管阵列紫外检测器作为定性定量手段，采用阳离子交换色谱方法，建立了一种回收率高，快捷，稳定的乳制品中三聚氰胺的检测方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 996PAD二极管阵列检测器（美国waters公司）；涡旋混合仪；（上海沪西分析仪器厂，WH-3）超声清洗器（上海KU-DOS超声仪器有限公司，SK7200LH）。
三聚氰胺标准品（纯度大于99%，百灵威公司）用1：1甲醇水配制成10ttg/mL的标准储备液，于-4℃下避光保存，根据需要稀释成适当浓度的工作液。实验所用液态奶样品，奶粉样品均为武汉产品质量监督检验所日常检测用品。
2.2实验方法
2.2.1超声萃取条件
取2.00g液体奶样品置于50.0mL比色管中，然后加入10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混匀，超声提取15min后，再次涡旋混匀，静置，取上清液过0.2tim微孔滤膜，备检测用。
取2.00g奶粉样品置于50.0mL比色管中，先加入5.00mL二次水溶解，涡旋混匀后，与液体奶预处理步骤相同。
2.2.2色谱条件
色谱柱：Luna—scx（4.6×250mm，5μm，美国菲罗门公司）；流动相：A相为50mmol磷酸二氢钾溶液（pH=2.5），B相为乙腈，A：B=35：65，等度洗脱；流速：1.0mL/min；进样量：30μL；检测波长：235nm。
3结果与讨论
3.1超神萃取条件的优化
3.1.1萃取方法及萃取液的选择
通常用液一液萃取法提取乳制品中的三聚氰胺，由于乳制品中蛋白质的含量较多，蛋白质变性后会将中心的样品包裹起来，即使通过超声波，高速振荡等方法也很难将包被层破坏掉，使样品不能被充分的提取。本文针对乳制品的特点，分别称取5份空白液体奶样品和奶粉样品，添加10μg/g的三聚氰胺标准工作液，分别用5种不同提取液进行预处理，用LC—PAD进行分离检测，结果如表1所示。
由表1可见，单独使用甲醇回收率很低；使用乙腈做提取液回收率提高到83.2%，但仍不能满足分析的要求；1：1甲醇与水的混合溶剂进行提取时发现蛋白质沉降缓慢，需进行12000r高速离心才能够分层。先用1%三氯乙酸水溶液，然后用乙腈提取回收率叶较低；单独用三氯乙酸提取，回收率只有35.%，仍无法满足分析要求。含有1%三氯乙酸的乙腈溶液进行提取，液态奶与奶粉的回收率均在93%以上，效果最佳。因此本研究确定提取液为1%三氯乙酸乙腈溶液。
3.1.2提取液体积的优化
萃取液体积对回收率有重要影响。为了确保三聚氰胺能够全部提取出来，本研究提高了液态奶及奶粉中的添加水平（500μg/g），先按照3.1.1确定的方法分别加入5.00mL，10.00mL，15.00mL，20.00mL，25.00mL，30.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混合，超声提取15min，进行分离检测。试验结果如图1所示，结果表明，提取液体积在大于10.00mL后，提取出的三聚氰胺的总量不再增加。提取液体积为5.00mL时，反应体系不易分层，需用12000r/min转速离心；若提取液体积过大，会因稀释比例过大导致方法检出限偏高。故本文提取液用量定为10.00mL。
3.1.3超声提取时间的优化
超声提取时间可影响三聚氰胺的回收率。分别称取5份空白液体奶样品和奶粉样品，添加三聚氰胺标准工作液到10/μg/g，按照3.1.1和3.1.2节所述方法，分别加入10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混合，分别超声提取0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min，然后进行分离检测，结果如图2所示。结果表明，超声提取能够大幅提高回收率，在超声时间大于15min之后，三聚氰胺的回收率基本不再增加。故本文超声提取时间定为15min。
3.2色谱条件的优化
比较了C8（4.6×250mm，5/μm），C18（4.6×250mm，5μm）和Luna—sex（4.6×250mm，5/μm）三种色谱柱的分离情况。其中C8柱和C18柱按照国标方法给定的色谱条件进行实验。实验结果表明，选用C8柱和C18柱，应用离子对试剂进行分离，空白样品中有一杂质峰与目标峰发生重叠，检测结果受到较大干扰，如图3（a），（b）所示分别为应用C8柱和C18柱的空白样品和三聚氰胺标准品的色谱图。
而选用强阳离子型色谱柱Luna—SCX，以50mmol磷酸盐（pH=2.5）：乙腈（35：65）为流动相，大部分杂质在死时间即被洗脱，能够很好的与所有杂质峰分离，见图3（c），分别是空白样品，三聚氰胺标准品及空白加标样品的色谱图。由图可见，杂质峰和三聚氰胺完全得到分离，因此本研究选择上述Luna-scx色谱柱作为分离柱；选用235nm作为检测波长。
3.3方法的线性范围，检出限。回收率和精密度
采用外标法定量，三聚氰胺在液态奶及奶粉中的线性范围为0.5～400μg/g，相关系数均大于0.99。以阴性样品为测试样品，添加不同浓度水平的三聚氰胺，每个水平做6个平行样，计算回收率、相对标准偏差（RSD），结果见表2。通过低浓度（0.5μg/kg）添加样品，以3倍信噪比为检出限（LOD），计算得出三聚氰胺的检出限为0.02μg/g，同样条件下，以10倍信噪比为定量下限（LOQ），计算出三聚氰胺的定量下限为0.5μg/g。
3.4乳制品中三聚氰胺的测定
测定了5种乳制品，分别是原料牛奶，成品纯牛奶，成品乳酸菌饮料，成品酸奶及成品奶粉。样品按照本文确定的前处理方法进行预处理后，以30μL直接进样分析，所得结果如表3所示。三聚氰胺在5种乳制品中的回收率为94.6%～100.2%。
采用超声萃取能有效降低乳制品的基体干扰，与离子交换色谱联用检测乳制品中三聚氰胺，具有检出限低，杂质干扰少，样品前处理步骤简单，回收率稳定等优点，可用于实际奶制品中三聚氰胺的检测。
关键词：超声萃取；三聚氰胺；乳制品；阳离子交换色谱
中图分类号：TB 文献标识码：A doi：10.19311/j.cnki.1672-3198.2016.06.092
1引言
由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量。宠物饲料及婴幼儿奶粉中非法添加三聚氰胺，造成对健康的危害。三聚氰胺的检测颇受关注。目前对三聚氰胺的检测主要局限于饲料类产品，多用离子对色谱法，虽然国家已出台了三聚氰胺的检测标准，前处理采用固相萃取技术，存在费时费力，有机溶剂使用量较大的缺点。国外关于三聚氰胺的分析方法主要是色谱法，如HPLC，GC/MS和LC/MS/MS，也有用拉曼光谱进行检测的报道，但均未见乳制品中三聚氰胺检测的报道。乳制品含有脂肪、蛋白质，若前处理不好，低含量的三聚氰胺的检测易受干扰。超声萃取是一种有效的前处理方法，萃取溶剂的选择对超声萃取效果影响极大。针对目前乳制品中三聚氰胺的检测样品量大，建立简单、快速、可靠的乳制品中三聚氰胺的分析方法非常必要。
本文采用1%三氯乙酸乙腈溶液为提取液的超声萃取为前处理方法，以二极管阵列紫外检测器作为定性定量手段，采用阳离子交换色谱方法，建立了一种回收率高，快捷，稳定的乳制品中三聚氰胺的检测方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 996PAD二极管阵列检测器（美国waters公司）；涡旋混合仪；（上海沪西分析仪器厂，WH-3）超声清洗器（上海KU-DOS超声仪器有限公司，SK7200LH）。
三聚氰胺标准品（纯度大于99%，百灵威公司）用1：1甲醇水配制成10ttg/mL的标准储备液，于-4℃下避光保存，根据需要稀释成适当浓度的工作液。实验所用液态奶样品，奶粉样品均为武汉产品质量监督检验所日常检测用品。
2.2实验方法
2.2.1超声萃取条件
取2.00g液体奶样品置于50.0mL比色管中，然后加入10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混匀，超声提取15min后，再次涡旋混匀，静置，取上清液过0.2tim微孔滤膜，备检测用。
取2.00g奶粉样品置于50.0mL比色管中，先加入5.00mL二次水溶解，涡旋混匀后，与液体奶预处理步骤相同。
2.2.2色谱条件
色谱柱：Luna—scx（4.6×250mm，5μm，美国菲罗门公司）；流动相：A相为50mmol磷酸二氢钾溶液（pH=2.5），B相为乙腈，A：B=35：65，等度洗脱；流速：1.0mL/min；进样量：30μL；检测波长：235nm。
3结果与讨论
3.1超神萃取条件的优化
3.1.1萃取方法及萃取液的选择
通常用液一液萃取法提取乳制品中的三聚氰胺，由于乳制品中蛋白质的含量较多，蛋白质变性后会将中心的样品包裹起来，即使通过超声波，高速振荡等方法也很难将包被层破坏掉，使样品不能被充分的提取。本文针对乳制品的特点，分别称取5份空白液体奶样品和奶粉样品，添加10μg/g的三聚氰胺标准工作液，分别用5种不同提取液进行预处理，用LC—PAD进行分离检测，结果如表1所示。
由表1可见，单独使用甲醇回收率很低；使用乙腈做提取液回收率提高到83.2%，但仍不能满足分析的要求；1：1甲醇与水的混合溶剂进行提取时发现蛋白质沉降缓慢，需进行12000r高速离心才能够分层。先用1%三氯乙酸水溶液，然后用乙腈提取回收率叶较低；单独用三氯乙酸提取，回收率只有35.%，仍无法满足分析要求。含有1%三氯乙酸的乙腈溶液进行提取，液态奶与奶粉的回收率均在93%以上，效果最佳。因此本研究确定提取液为1%三氯乙酸乙腈溶液。
3.1.2提取液体积的优化
萃取液体积对回收率有重要影响。为了确保三聚氰胺能够全部提取出来，本研究提高了液态奶及奶粉中的添加水平（500μg/g），先按照3.1.1确定的方法分别加入5.00mL，10.00mL，15.00mL，20.00mL，25.00mL，30.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混合，超声提取15min，进行分离检测。试验结果如图1所示，结果表明，提取液体积在大于10.00mL后，提取出的三聚氰胺的总量不再增加。提取液体积为5.00mL时，反应体系不易分层，需用12000r/min转速离心；若提取液体积过大，会因稀释比例过大导致方法检出限偏高。故本文提取液用量定为10.00mL。
3.1.3超声提取时间的优化
超声提取时间可影响三聚氰胺的回收率。分别称取5份空白液体奶样品和奶粉样品，添加三聚氰胺标准工作液到10/μg/g，按照3.1.1和3.1.2节所述方法，分别加入10.00mL1%三氯乙酸乙腈溶液，涡旋混合，分别超声提取0min，5min，10min，15min，20min，25min，30min，然后进行分离检测，结果如图2所示。结果表明，超声提取能够大幅提高回收率，在超声时间大于15min之后，三聚氰胺的回收率基本不再增加。故本文超声提取时间定为15min。
3.2色谱条件的优化
比较了C8（4.6×250mm，5/μm），C18（4.6×250mm，5μm）和Luna—sex（4.6×250mm，5/μm）三种色谱柱的分离情况。其中C8柱和C18柱按照国标方法给定的色谱条件进行实验。实验结果表明，选用C8柱和C18柱，应用离子对试剂进行分离，空白样品中有一杂质峰与目标峰发生重叠，检测结果受到较大干扰，如图3（a），（b）所示分别为应用C8柱和C18柱的空白样品和三聚氰胺标准品的色谱图。
而选用强阳离子型色谱柱Luna—SCX，以50mmol磷酸盐（pH=2.5）：乙腈（35：65）为流动相，大部分杂质在死时间即被洗脱，能够很好的与所有杂质峰分离，见图3（c），分别是空白样品，三聚氰胺标准品及空白加标样品的色谱图。由图可见，杂质峰和三聚氰胺完全得到分离，因此本研究选择上述Luna-scx色谱柱作为分离柱；选用235nm作为检测波长。
3.3方法的线性范围，检出限。回收率和精密度
采用外标法定量，三聚氰胺在液态奶及奶粉中的线性范围为0.5～400μg/g，相关系数均大于0.99。以阴性样品为测试样品，添加不同浓度水平的三聚氰胺，每个水平做6个平行样，计算回收率、相对标准偏差（RSD），结果见表2。通过低浓度（0.5μg/kg）添加样品，以3倍信噪比为检出限（LOD），计算得出三聚氰胺的检出限为0.02μg/g，同样条件下，以10倍信噪比为定量下限（LOQ），计算出三聚氰胺的定量下限为0.5μg/g。
3.4乳制品中三聚氰胺的测定
测定了5种乳制品，分别是原料牛奶，成品纯牛奶，成品乳酸菌饮料，成品酸奶及成品奶粉。样品按照本文确定的前处理方法进行预处理后，以30μL直接进样分析，所得结果如表3所示。三聚氰胺在5种乳制品中的回收率为94.6%～100.2%。
采用超声萃取能有效降低乳制品的基体干扰，与离子交换色谱联用检测乳制品中三聚氰胺，具有检出限低，杂质干扰少，样品前处理步骤简单，回收率稳定等优点，可用于实际奶制品中三聚氰胺的检测。