论文部分内容阅读
【摘要】 目的：探讨三氧化二砷（（Arsenic trioxide，As2O3）对食管癌细胞株EC-1生长抑制作用及机制。方法：采用MTT法检测不同浓度As2O3 （0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L）在不同时间段（24、48、72 h）对EC-1细胞增殖的抑制率，计算半数抑制率（IC50）值。流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化。结果：三氧化二砷对食管癌EC-1细胞具有增殖抑制作用，呈剂量-效应和时间-效应关系（P<0.05）。IC50约为18.74 μmol/L。As2O3可使细胞阻滞在G2/M期，使G0/G1期、S期细胞比例减少，增加细胞凋亡，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论： As2O3能抑制食管癌EC-l细胞株的增殖，具有明显的量效和时效关系。其机制可能与改变周期，增加其细胞凋亡有关。
【关键词】 食管癌EC-1细胞系； 三氧化二砷
Effets of Aresenic Trioxide on Esophageal Squamous Carcinoma Cell Line EC-1/GU Jian-fa，WANG Xiao-min，LU Ping.//Medical Innovation of China，2015，12（30）：116-118
【Abstract】 Objective： To investigate effects of arsenic trioxide （As2O3） on esophageal squamous carcinoma cell line EC-1. Method：The inhibition effect of As2O3（different doses of 0.5，1，2，4，8，16，32，64 μmol/L） on EC-1 cells proliferation at different time points（24，48，72 h） was detected by MTT assay，and the value of IC50 was calculated .Cell cycle change and cell apoptosis were detected by flow cytometric analysis （FCM）.Result：As2O3 was able to inhibit the proliferation of esophageal squamous carcinoma cell line EC-1，with the dose of As2O3 increasing and the effect time prolonging，the inhibition of cells proliferation was enhanced.The IC50 in EC-1 cells was 18.74 μmol/L. As2O3 could induced G2/M phase arrest and the reduction of the ratio of cells in G0/G1 and S phases expectively. As2O3 could enhance the radiation-induced apoptosis. Conclusion： The proliefration inhibition action of As2O3 on esophageal cell line Ec-1 depends on the concentration and the contact time. As2O3 hyperthermia can enhance the killing effect of radiation on tumour cells mainly through affecting the EC-l cell cycle， and the induction of apoptosis is the second reason.
【Key words】 Human esophageal carcinoma EC-1 cell line； Arsenic trioxide
First-author’s address：Zhengzhou Center Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Zhengzhou 450007，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.30.038
中药砒霜的有效成份即为三氧化二砷（As2O3），可使急性早幼粒细胞白血病临床缓解率达到80%以上[1-2]。许多研究证实，As2O3对多种实体瘤如肝癌[3]、乳腺癌细胞[4-5] 、胃癌[6] 、骨髓瘤[7] 、淋巴瘤[8] 、肾母细胞瘤[9]等都有明显的增殖抑制作用。但在食管癌[10]方面，相关研究报道较少见。而食管癌是我国常见肿瘤[11]。本研究探讨食管癌EC-1细胞在三氧化二砷作用的变化，并寻找其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人食管癌细胞株EC-1细胞。
1.1.2 主要仪器 MULTISKAN MK3酶标仪（美国 Thermo electron公司）恒温细胞培养箱（英国RSBionch公司）；Epic XL II型里流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司），倒置显微镜（EE 2000-U）（日本Nikon公司），OLYMPUS直立光照照相系统（日本Olympus公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 EC-1细胞增殖反应检测 采用MTT法，实验根据三氧化二砷浓度分八组：64、32、、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L。以每孔6×l03个细胞接种在96孔板内，细胞贴壁后，加入用上述不同最终浓度的As2O3，放入孵箱继续培养。观察24、48、72 h后取出培养板，每孔加入MTT液20 uL，继续孵育4 h，弃内液。每孔再加入二甲亚矾，放在震荡混合仪上常温震荡10 min。在酶标仪读取492 nm的吸光度（OD），计算抑制率。实验取3个平行孔，重复3次，取平均值。抑制率（%）=1-（实验组平均OD值/对照组OD值）×100%。 1.2.2 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 取在指数生长期的EC-1细胞，把细胞浓度调整为1×105/mL接种6孔培养板内，接种后24 h后，实验组加三氧化二砷处理。48 h培养后，消化离心成单细胞悬液，冷PBS洗涤两次。PBS打散制成细胞悬液，加进5 μL RNA酶（10 mg/mL），放在37 ℃水中1 h。加入50 μL碘化丙啶，30 min避光染色，400目筛网滤过后，样品在流式细胞仪在488 nm处检测。
1.3 统计学处理 采用软件SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 MTT法检测As2O3对EC-l的增殖抑制作用 MTT法检测不同浓度（64、32、16、8、4、2、l、0.5 μmol/L）的As2O3对食管癌EC-1细胞作用24、48、72 h后的增殖抑制作用，结果显示：随浓度升高，抑制作用增强，随作用时间延长，抑制作用增强，即存在量效和时效关系。图1可见，抑制率与As2O3浓度表现出梯度变化的曲线关系，并求出As2O3作用食管癌EC-1细胞48 h的半数抑制率（IC50）为18.74 μmol/L。图中也可见细胞抑制率为50%时对应的药物浓度大致为19 μmol/L。
图1 三氧化二砷对食管癌EC-1细胞的抑制作用
2.2 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 为探讨As2O3对人食管癌EC-1细胞作用机制，以流式细胞仪检测各组细胞的细胞凋亡改变及细胞周期分布的变化。表1可见As2O3可使细胞阻滞在G2/M期，使G0/G1期、S期细胞比例减少，增加细胞凋亡。
3 讨论
中药砒霜的主要组分即为As2O3，其用于治疗疾病已有源远流长的历史，但其毒性大，限制了在临床上的广泛使用。在上世纪70年代，国内学者应用主要成分为As2O3的癌灵1号在急性早幼粒细胞白血病疗效显著。随后更多的学者开始进行实体瘤的基础与临床研究，在食管癌方面，景绍武[12]发现As2O3能增加放疗对食管癌细胞株Eca109增殖的抑制作用。
笔者在实验中发现MTT法检测了不同浓度对食管癌EC-1细胞的增值抑制的结果显示：As2O3对食管癌EC-1细胞具有抑制增殖作用，且随时间延长，剂量增加而抑制作用更明显，即呈时效和剂效关系，与景绍武[12]用As2O3作用于食管癌细胞株Eca109的研究结果符合。
本实验经流式细胞术检测细胞周期及凋亡，结果表明 As2O3主要使细胞周期在G2/M期阻滞，G0/G1期细胞减少，与Ling等[13]同在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞系，李岚[14]在胃癌BGC-823细胞研究结果符合。但也有研究报告As2O3在多发性骨髓瘤细胞中，细胞在G2/M期及G1期阻滞[15]，这可能与不同细胞系有关。综上所述，As2O3对食管癌EC-1细胞有抑制作用，为以后的动物实验和临床研究提供依据。
参考文献
[1] 罗贞. 42例急性早幼粒细胞白血病患者的治疗方案和疗效分析[J]. 中国医学创新，2011，8（20）：27-28.
[2]林海清.三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病50例疗效观察[J]. 中国医学创新，2010，7（4）：182-183.
[3]李海燕，曹励民，王娟.三氧化二砷对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响[J]. 中国老年学杂志，2013，33（11）：2572-2574.
[4] 胡磊，张安庆，叶显道，等.三氧化二砷对三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的化疗增敏作用[J].安徽医药，2013，17（6）：1038-1039.
[5] 赵振江，李海新.三氧化二砷对乳腺癌细胞株的抑制作用及其机制探讨[J]. 中国医学创新，2011，8（16）：20-21.
[6] 徐尔康，尹春燕，肖延风，等.三氧化二砷对胃癌细胞系SGC7901的生长及VEGF表达的影响[J].现代肿瘤医学，2013，21（11）：2419-2422.
[7] 王智，赵晓红， 陆时运，等. 三氧化二砷联合沙利度胺治疗复发难治性多发性骨髓瘤临床研究[J]. 中国医学创新，2010，7（34）：33-35.
[8] 沈润， 三氧化二砷联合化疗治疗难治性恶性淋巴瘤的效果观察[J].广东医学院学报， 2014， 32（5）：646-648.
[9] 卢立慧， 薛天阳， 许伟，等.三氧化二砷对肾母细胞瘤增殖及凋亡的影响[J].上海交通大学学报（医学版）， 2015， 35（2）：291-294.
[10]梅开.同步放化疗与序贯放化疗治疗中晚期食管癌的临床疗效对比[J].中国医学创新，2014，11（2）：1-2.
[11] 张思维，张敏，李光琳，等.2003～2007年中国食管癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤学， 2012， 21（4）：241-247.
[12] 景绍武，王雅棣，吴风鹏，等.三氧化二砷与放射线联合对食管癌细胞株Eca109的增敏机制[J].肿瘤防治研究，2011，38（6）：620-623.
[13] Ling Y H，Jmng J D，Holland J F，et a1.Arsenic trioxide produces polymerization of microtubules and mitotic arrest before apoptosis in human tumor cell lines[J].Mol Pharmacol，2002，62（3）：529-538.
[14] 李岚，张敬东，刘云鹏，等.三氧化二砷对胃癌BGC-823细胞增殖及细胞周期的影响[J].肿瘤学杂志，2008，14（3）：190-192.
[15] Park W H，Seol J G，Kim E S，et al.Arsenic trioxide-mediated growth inhibition in MC/Car myeloma cells via cell cycle arrest in association with induction of cyclin-dependent kinase inhibitor，p21，and apoptosis[J].Cancer Res，2000，60（11）：3065-3071.
（收稿日期：2015-07-05） （本文编辑：陈丹云）
【关键词】 食管癌EC-1细胞系； 三氧化二砷
Effets of Aresenic Trioxide on Esophageal Squamous Carcinoma Cell Line EC-1/GU Jian-fa，WANG Xiao-min，LU Ping.//Medical Innovation of China，2015，12（30）：116-118
【Abstract】 Objective： To investigate effects of arsenic trioxide （As2O3） on esophageal squamous carcinoma cell line EC-1. Method：The inhibition effect of As2O3（different doses of 0.5，1，2，4，8，16，32，64 μmol/L） on EC-1 cells proliferation at different time points（24，48，72 h） was detected by MTT assay，and the value of IC50 was calculated .Cell cycle change and cell apoptosis were detected by flow cytometric analysis （FCM）.Result：As2O3 was able to inhibit the proliferation of esophageal squamous carcinoma cell line EC-1，with the dose of As2O3 increasing and the effect time prolonging，the inhibition of cells proliferation was enhanced.The IC50 in EC-1 cells was 18.74 μmol/L. As2O3 could induced G2/M phase arrest and the reduction of the ratio of cells in G0/G1 and S phases expectively. As2O3 could enhance the radiation-induced apoptosis. Conclusion： The proliefration inhibition action of As2O3 on esophageal cell line Ec-1 depends on the concentration and the contact time. As2O3 hyperthermia can enhance the killing effect of radiation on tumour cells mainly through affecting the EC-l cell cycle， and the induction of apoptosis is the second reason.
【Key words】 Human esophageal carcinoma EC-1 cell line； Arsenic trioxide
First-author’s address：Zhengzhou Center Hospital Affiliated to Zhengzhou University， Zhengzhou 450007，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.30.038
中药砒霜的有效成份即为三氧化二砷（As2O3），可使急性早幼粒细胞白血病临床缓解率达到80%以上[1-2]。许多研究证实，As2O3对多种实体瘤如肝癌[3]、乳腺癌细胞[4-5] 、胃癌[6] 、骨髓瘤[7] 、淋巴瘤[8] 、肾母细胞瘤[9]等都有明显的增殖抑制作用。但在食管癌[10]方面，相关研究报道较少见。而食管癌是我国常见肿瘤[11]。本研究探讨食管癌EC-1细胞在三氧化二砷作用的变化，并寻找其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人食管癌细胞株EC-1细胞。
1.1.2 主要仪器 MULTISKAN MK3酶标仪（美国 Thermo electron公司）恒温细胞培养箱（英国RSBionch公司）；Epic XL II型里流式细胞仪（美国 Beckman Coulter公司），倒置显微镜（EE 2000-U）（日本Nikon公司），OLYMPUS直立光照照相系统（日本Olympus公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 EC-1细胞增殖反应检测 采用MTT法，实验根据三氧化二砷浓度分八组：64、32、、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L。以每孔6×l03个细胞接种在96孔板内，细胞贴壁后，加入用上述不同最终浓度的As2O3，放入孵箱继续培养。观察24、48、72 h后取出培养板，每孔加入MTT液20 uL，继续孵育4 h，弃内液。每孔再加入二甲亚矾，放在震荡混合仪上常温震荡10 min。在酶标仪读取492 nm的吸光度（OD），计算抑制率。实验取3个平行孔，重复3次，取平均值。抑制率（%）=1-（实验组平均OD值/对照组OD值）×100%。 1.2.2 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 取在指数生长期的EC-1细胞，把细胞浓度调整为1×105/mL接种6孔培养板内，接种后24 h后，实验组加三氧化二砷处理。48 h培养后，消化离心成单细胞悬液，冷PBS洗涤两次。PBS打散制成细胞悬液，加进5 μL RNA酶（10 mg/mL），放在37 ℃水中1 h。加入50 μL碘化丙啶，30 min避光染色，400目筛网滤过后，样品在流式细胞仪在488 nm处检测。
1.3 统计学处理 采用软件SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 MTT法检测As2O3对EC-l的增殖抑制作用 MTT法检测不同浓度（64、32、16、8、4、2、l、0.5 μmol/L）的As2O3对食管癌EC-1细胞作用24、48、72 h后的增殖抑制作用，结果显示：随浓度升高，抑制作用增强，随作用时间延长，抑制作用增强，即存在量效和时效关系。图1可见，抑制率与As2O3浓度表现出梯度变化的曲线关系，并求出As2O3作用食管癌EC-1细胞48 h的半数抑制率（IC50）为18.74 μmol/L。图中也可见细胞抑制率为50%时对应的药物浓度大致为19 μmol/L。
图1 三氧化二砷对食管癌EC-1细胞的抑制作用
2.2 流式细胞仪分析细胞周期及凋亡 为探讨As2O3对人食管癌EC-1细胞作用机制，以流式细胞仪检测各组细胞的细胞凋亡改变及细胞周期分布的变化。表1可见As2O3可使细胞阻滞在G2/M期，使G0/G1期、S期细胞比例减少，增加细胞凋亡。
3 讨论
中药砒霜的主要组分即为As2O3，其用于治疗疾病已有源远流长的历史，但其毒性大，限制了在临床上的广泛使用。在上世纪70年代，国内学者应用主要成分为As2O3的癌灵1号在急性早幼粒细胞白血病疗效显著。随后更多的学者开始进行实体瘤的基础与临床研究，在食管癌方面，景绍武[12]发现As2O3能增加放疗对食管癌细胞株Eca109增殖的抑制作用。
笔者在实验中发现MTT法检测了不同浓度对食管癌EC-1细胞的增值抑制的结果显示：As2O3对食管癌EC-1细胞具有抑制增殖作用，且随时间延长，剂量增加而抑制作用更明显，即呈时效和剂效关系，与景绍武[12]用As2O3作用于食管癌细胞株Eca109的研究结果符合。
本实验经流式细胞术检测细胞周期及凋亡，结果表明 As2O3主要使细胞周期在G2/M期阻滞，G0/G1期细胞减少，与Ling等[13]同在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞系，李岚[14]在胃癌BGC-823细胞研究结果符合。但也有研究报告As2O3在多发性骨髓瘤细胞中，细胞在G2/M期及G1期阻滞[15]，这可能与不同细胞系有关。综上所述，As2O3对食管癌EC-1细胞有抑制作用，为以后的动物实验和临床研究提供依据。
参考文献
[1] 罗贞. 42例急性早幼粒细胞白血病患者的治疗方案和疗效分析[J]. 中国医学创新，2011，8（20）：27-28.
[2]林海清.三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病50例疗效观察[J]. 中国医学创新，2010，7（4）：182-183.
[3]李海燕，曹励民，王娟.三氧化二砷对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响[J]. 中国老年学杂志，2013，33（11）：2572-2574.
[4] 胡磊，张安庆，叶显道，等.三氧化二砷对三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的化疗增敏作用[J].安徽医药，2013，17（6）：1038-1039.
[5] 赵振江，李海新.三氧化二砷对乳腺癌细胞株的抑制作用及其机制探讨[J]. 中国医学创新，2011，8（16）：20-21.
[6] 徐尔康，尹春燕，肖延风，等.三氧化二砷对胃癌细胞系SGC7901的生长及VEGF表达的影响[J].现代肿瘤医学，2013，21（11）：2419-2422.
[7] 王智，赵晓红， 陆时运，等. 三氧化二砷联合沙利度胺治疗复发难治性多发性骨髓瘤临床研究[J]. 中国医学创新，2010，7（34）：33-35.
[8] 沈润， 三氧化二砷联合化疗治疗难治性恶性淋巴瘤的效果观察[J].广东医学院学报， 2014， 32（5）：646-648.
[9] 卢立慧， 薛天阳， 许伟，等.三氧化二砷对肾母细胞瘤增殖及凋亡的影响[J].上海交通大学学报（医学版）， 2015， 35（2）：291-294.
[10]梅开.同步放化疗与序贯放化疗治疗中晚期食管癌的临床疗效对比[J].中国医学创新，2014，11（2）：1-2.
[11] 张思维，张敏，李光琳，等.2003～2007年中国食管癌发病与死亡分析[J].中国肿瘤学， 2012， 21（4）：241-247.
[12] 景绍武，王雅棣，吴风鹏，等.三氧化二砷与放射线联合对食管癌细胞株Eca109的增敏机制[J].肿瘤防治研究，2011，38（6）：620-623.
[13] Ling Y H，Jmng J D，Holland J F，et a1.Arsenic trioxide produces polymerization of microtubules and mitotic arrest before apoptosis in human tumor cell lines[J].Mol Pharmacol，2002，62（3）：529-538.
[14] 李岚，张敬东，刘云鹏，等.三氧化二砷对胃癌BGC-823细胞增殖及细胞周期的影响[J].肿瘤学杂志，2008，14（3）：190-192.
[15] Park W H，Seol J G，Kim E S，et al.Arsenic trioxide-mediated growth inhibition in MC/Car myeloma cells via cell cycle arrest in association with induction of cyclin-dependent kinase inhibitor，p21，and apoptosis[J].Cancer Res，2000，60（11）：3065-3071.
（收稿日期：2015-07-05） （本文编辑：陈丹云）