固相萃取—高效液相色谱法测定渔业水体中16种多环芳烃

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  摘要:渔业水体样品经HLB小柱净化和富集,采用荧光-紫外检测器串联方法对多环芳烃进行检测,结果表明,高效液相色谱分析方法对16种多环芳烃分离效果好,检出限(LOD)为0.001~0.01 μg/L,相对标准偏差为1.2%~9.5%(n=6),加标回收率为72.1%~98.3%。该方法重现性和选择性较高,对水体多环芳烃的残留测定具有很好的应用前景。
  关键词:固相萃取;高效液相色谱法;多环芳烃;渔业水体
  中图分类号: X131.2文献标志码: A文章编号:1002-1302(2015)01-0280-04
  收稿日期:2014-01-08
  基金项目:湖南省养殖业科研项目(编号:201115)。
  作者简介:万译文(1984—),男,湖南张家界人,硕士,助理研究员,从事食品质量与环境分析化学研究。E-mail:cnjs3385@163.com。
  通信作者:黄向荣,副研究员,从事水产品质量安全和渔业生态环境监测研究。E-mail:hns-11@126.com。多环芳烃(PAHs)类化合物是一种性质稳定、惰性较强的碳氢化合物,具有疏水性、半挥发性及难降解等特点,容易在生物体内富集[1-3]。PAHs能抑制植物的生长,对人类有明显的致癌、致畸、致突变效应,已成为世界范围的研究热点[4-5]。欧盟食品科学委员会与美国环保局(USEPA)在2002年将16种PAHs列为优先控制污染物,我国环保总局将其中7种PAHs列入优先控制污染物名单。
  我国是渔业大国,也是世界上最大的渔业养殖国,随着我国工业化及城市化的快速发展,燃煤、燃油被广泛应用,产生的污染物不断排入水域中,对渔业养殖带来很大危害,并影响我国水产品出口和人民身体健康。目前,多环芳烃的检测方法主要有气相色谱法(GC)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS)等[6-11]。徐媛等采用氢火焰离子化检测器(FID)气相色谱法对海水中多环芳烃进行检测[12];牛宏亮等利用气相色谱-质谱联用技术(FID-GC-MS)测定烤羊肉串中的多环芳烃[13];林直宏等采用高效液相色谱-紫外法测定油漆中的16种多环芳烃[14],但不能满足水体中低浓度样品的分析要求;孙秀梅等采用高效液相色谱-荧光法测定水产品中的15种多环芳烃[15],虽能满足水体中低浓度样品的分析,但苊烯在荧光检测器上没有响应,且采用单一波长不能测定除苊烯外的15种PAHs、梯度洗脱效果不佳。
  气相色谱法对高温下易分解的高环PAHs检测灵敏度不高、回收率不理想;采用气相色谱-质谱联用技术对各种PAHs能获得较为理想的回收率和精密度,但前处理复杂,耗时长,有机溶剂使用多;高效液相色谱法可选紫外和荧光检测器用于环境中PAHs的测定。本试验采用固相萃取技术对水样进行处理,通过对试验条件筛选和试验方法改进,利用高效液相色谱-荧光紫外联测定渔业水体中的16种多环芳烃,以期缩短前处理时间,提高试验灵敏度,实现对多环芳烃的快速检测。
  1材料与方法
  1.1仪器与试剂
  Waters Alliance 2695高效液相色谱仪,配备2489紫外可见光检测器和2475多波长荧光检测器;4.6 mm×250 mm、5 μm Waters LC-PAH柱;高速冷冻离心机,日本日立公司生产;氮气吹扫仪,美国Organomation公司生产;固相萃取装置,美国Agilent公司生产;整套过滤抽滤装置,天津奥特赛恩斯仪器有限公司生产;循环水式多用真空泵SHZ-D(Ⅲ),郑州长城科工贸有限公司生产。
  萘、苊、菲、蒽、芴、芘、、荧蒽、苊烯、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]苝和茚并[1,2,3-cd]芘共16种多环芳烃混合标液,浓度200 mg/L,美国Accustandard公司生产;甲醇色谱纯、乙腈色谱纯,德国Merck公司生产;二氯甲烷色谱纯,美国Tedia公司生产;HLB 6 mL/500 mg固相萃取小柱,美国Waters公司生产。
  1.2样品前处理
  1.2.1样品采集与改性剂用量筛选取样点水深1.5~3 m,将采集的水样用干净的棕色玻璃容器盛装,加入不同浓度甲醇作为有机改性剂并进行筛选。水样置于暗处,4 ℃冰箱保存,并在24 h内尽快进行样品预处理。
  1.2.2样品处理条件筛选将1 L水样加标样通过 0.45 μm 水相滤膜过滤;分别取C18、HLB、MCX、Alumina-N4种固相萃取柱500 mg/6 mL依次通过5 mL甲醇、10 mL水活化小柱,将过滤好的水样分别以5、8、10、20 mL/min左右流速通过萃取柱;依次用5 mL水、2 mL 5%甲醇淋洗以除去水溶性干扰物质,抽干小柱,使吸附好的SPE柱彻底干燥;分别采用4 mL二氯甲烷1次、4 mL二氯甲烷2次和9 mL二氯甲烷3次共3种方式进行洗脱,洗脱液用不同温度氮气将溶剂吹干或浓缩至约0.5、0.1 mL 3种情况,加入1.0 mL乙腈混匀,过0.22 μm滤膜。1 L待测水样用最佳条件进行处理。
  1.3色谱条件优化
  欧盟规定16种多环芳烃采用Waters 2695荧光检测器检测,由于苊烯荧光响应值低,但在紫外检测器中响应值较高,因此,采用荧光和紫外串联的方法对16种多环芳烃进行检测,通过试验分析对色谱条件予以优化。
  1.4多环芳烃测定
  采用2475多波长荧光检测器,程序定时控制荧光检测波长变化,测定除苊烯以外的15种多环芳烃(表1);采用2489紫外可见光检测器,与荧光检测器串联,于波长229 nm处检测定苊烯。
  2结果与分析   2.1改性剂用量筛选
  PAHs在水中溶解度较低,在水样采集过程中加入甲醇作为改性剂,可以改变目标物在水中的溶解性,增加PAHs在固相萃取柱填料表面的吸附能力,可以提高对目标物的提取效率。比较水样中分别加入0%、5%、10%、15% 4种甲醇用量对PAHs回收率的影响,由图1可见,水样不加入甲醇,16种PAHs回收率为47.6%~68.3%;分别加入5%、10%、15%
  甲醇,16种PAHs回收率分别为51.8%~73.5%、68.6%~902%、59.7%~79.3%;添加10%甲醇作为改性剂可使16种PAHs溶解度得到较大改善,PAHs回收率提高,但当甲醇加入量过大时,部分PAHs会随水样直接通过小柱而不被小柱吸附,导致回收率降低。
  2.2水样固相萃取处理条件筛选
  2.2.1固相萃取小柱筛选由图2可见,采用HLB固相萃取小柱对16种PAHs的回收相对最好,回收率为60.8%~88.6%;普通C18柱对PAHs中菲和蒽、苯并[b]荧蒽和苯并[k]荧蒽的分离效果不好。HLB固相萃取柱是一种高效、通用的反相吸附剂,可提取各种不同样品基质中酸性、中性及碱性物质,操作性能稳定且具有大的样品容量,可获得较高的回收率。
  2.2.2洗脱方式筛选对目标物洗脱方式进行试验,结果表明,4 mL二氯甲烷进行1次洗脱,目标物洗脱不完全,还有部分目标物残留在组合SPE柱上;4 mL二氯甲烷分2次(2×20 mL)洗脱,目标物被完全洗脱,回收率良好;9 mL二氯甲烷分3次(3×3.0 mL)洗脱,回收率与2次洗脱淋洗几乎相同。因此,试验选择操作简单、节约试剂的2次洗脱方式。
  2.2.3水样上样流速筛选比较上样流速分别为5、8、10、20 mL/min对目标物回收率的影响,结果表明,当流速小于 10 mL/min 时,回收率比较稳定;流速大于10 mL/min,部分PAHs的回收率降低,这可能是由于流速过快,部分目标物来不及吸附在小柱填料上。因此,试验采用上样流速为8 mL/min。
  2.2.4氮吹条件的考察将PAHs混合标准溶液在不同温度水浴中进行氮吹,结果表明,水浴温度高低对PAHs无明显影响;水浴温度适当提高,能够加快氮吹速度,缩短前处理时间,因此,为减少氮吹过程带来的影响,试验采用60 ℃水浴氮吹。比较氮吹过程中溶剂浓缩程度对PAHs回收率的影响,结果表明,溶剂吹干会大大降低萘、苊、芴、菲等PAHs的回收率,将溶剂浓缩至约0.1 mL时PAHs回收率较好。
  2.3色谱条件优化
  采用Waters的PAH专用柱,对流动相、柱温及流速等因素进行优化。由图3、图4可见,色谱条件为Waters LC-PAH色谱柱,柱温30 ℃,进样量20 μL,流动相A为乙腈,B为超纯水,流速为1.2 mL/min,洗脱梯度为0~11 min 60%A、11~20 min 60 %A~90%A、21~32 min 90%A,16种多环芳烃均能得到较好的分离。
  2.4线性方程与检出限
  配制0.001、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L系列标准工作溶液,以待测物浓度X(mg/L)为横坐标,待测物峰面积Y为纵坐标,制作标准曲线,得到PAHs回归方程和相关系数。由表2可知,PAHs在0.001~0.1 mg/L范围内,线性关系良好,可满足定量分析要求。以苯并(a)芘计,在500 mL纯水中添加0.1 mg/L PAHs混合标准溶液2 μg,对样品进行处理和浓缩,3倍信噪比(S/N=3)得到检出限LOD为0.001~001 μg/L。
  2.5回收率与精密度
  以苯并(a)芘计,在空白样品中添加1.0 mg/L PAHs混合标准溶液10.0、100 μL,每个添加水平重复3次,每次平行测定6次,由表3可见,PAHs回收率为72.1%~98.3%,相对标准偏差为1.2%~9.5%。
  2.6实际样品测定
  由表4可见,经检测,长沙市水产品养殖基地水样中含有萘、苊、芴、菲、荧蒽、芘、共7种多环芳烃物质,其中,以芘含量最高,为38.9 ng/L。
  3结论
  通过对固相萃取过程及色谱条件进行优化,建立固相萃取-高效液相色谱法检测渔业水体中PAHs的含量。结果表明,在0.001~0.1 mg/L范围内,该方法检测PAHs线性关系良好,检出限LOD在0.001~0.01 μg/L之间;在不同添加水平下,PAHs各组分平均回收率为72.1%~98.3%,相对标准偏差为1.2%~9.5%, 可满足渔业水体中微量和痕量 PAHs表216种PAHs的线性范围和灵敏度
  目标物线性范围
  (mg/L)线性方程r2LOD
  (μg/L)萘 (NAP)0.001~0.1Y=3.301 42 0.231 26X0.999 60.010苊烯 (ACY)0.001~0.1Y=-1.425 11 1.030 91X0.999 80.010苊 (ACE)0.001~0.1Y=39.763 10 2.337 53X0.999 80.003芴 (FLU)0.001~0.1Y=-3.528 34 3.174 33X0.999 80.003菲 (PHE)0.001~0.1Y=0.216 84 0.326 149X0.999 60.001蒽 (ANT)0.001~0.1Y=44.000 7 10.348 53X0.999 80.003荧蒽 (FLT)0.001~0.1Y=11.256 4 1.753 75X0.999 60.002芘 (PYR)0.001~0.1Y=3.529 52 0.552 13X0.999 90.001苯并[a]蒽 BaA0.001~0.1Y=0.027 65 2.838 61X0.999 90.002 (CHR)0.001~0.1Y=0.271 23 1.460 83X0.999 90.002苯并[b]荧蒽 (BbF)0.001~0.1Y=0.199 36 0.735 16X0.999 90.002苯并[k]荧蒽(BkF)0.001~0.1Y=-0.107 48 5.568 51X0.999 70.001苯并[a]芘 (BaP)0.001~0.1Y=-0.173 02 4.369 15X0.999 90.001二苯并[a,h]蒽 (DBA)0.001~0.1Y=-0.162 36 2.346 33X0.999 90.002苯并[g,h,i]苝 (BPY)0.001~0.1Y=-0.138 87 1.018 97X0.999 80.002茚并[1,2,3-cd]芘 (IND)0.001~0.1Y=-0.052 488 0.225 11X0.999 70.010   表3PAHs在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n=6)
  目标物10.0 μg/L100 μg/L回收率
  (%)相对标准
  偏差(%)回收率
  (%)相对标准
  偏差(%)萘 (NAP)83.22.176.43.4苊烯 (ACY)79.83.577.33.0苊 (ACE)85.64.280.21.2芴 (FLU)80.01.677.62.7菲 (PHE)87.97.376.39.5蒽 (ANT)81.34.382.02.8荧蒽 (FLT)88.65.084.66.5芘 (PYR)85.94.988.15.4苯并[a]蒽 (BaA)88.33.291.14.7 (CHR)92.62.780.74.8苯并[b]荧蒽 (BbF)98.32.181.13.6苯并[k]荧蒽(BkF)80.46.581.62.0苯并[a]芘 (BaP)76.73.379.71.9二苯并[a,h]蒽 (DBA)83.93.872.14.7苯并[g,h,i]苝 (BPY)84.62.985.43.8茚并[1,2,3-cd]芘 (IND)87.02.473.25.5
  的分析要求。
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  表4渔业水体中PAHs的含量(n=3)
  目标物含量(ng/L)萘 (NAP)25.4±6.79苊烯 (ACY)ND苊 (ACE)13.2±4.06芴 (FLU)16.5±7.20菲 (PHE)33.0±1.06蒽 (ANT)ND荧蒽 (FLT)33.5±3.92芘 (PYR)38.9±2.74苯并[a]蒽 (BaA)ND (CHR)8.41±2.10苯并[b]荧蒽 (BbF)ND苯并[k]荧蒽(BkF)ND苯并[a]芘 (BaP)ND二苯并[a,h]蒽 (DBA)ND苯并[g,h,i]苝 (BPY)ND茚并[1,2,3-cd]芘 (IND)ND注:ND表示未检测到。
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