【摘 要】
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单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5\'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作为哺乳细胞内调控代谢的关键酶,在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,但目前AMPK的催化亚基AMPKα1在小鼠(Mus musculus)卵母细胞成熟过程中发挥的作用尚不清楚.本研究利用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术对小鼠AMPKα1基因的多个位点进行了突变,分别获得AMPKα1-D157A、
【机 构】
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西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术研究中心,杨凌712100
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单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5\'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)作为哺乳细胞内调控代谢的关键酶,在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,但目前AMPK的催化亚基AMPKα1在小鼠(Mus musculus)卵母细胞成熟过程中发挥的作用尚不清楚.本研究利用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术对小鼠AMPKα1基因的多个位点进行了突变,分别获得AMPKα1-D157A、AMPKα1-T172D、AMPKα1-S485A以及AMPKα1-S485A-S173A突变体,在Hela细胞系中验证其功能后体外转录得到cRNAs,并通过显微注射技术在小鼠卵母细胞中超表达含有各突变位点的AMPKα1基因.结果显示,AMPKα1及其突变体在Hela细胞的胞质内广泛分布,且超表达AMPKα1-S485A突变体的细胞增殖数量和活性均增加;同时,AMPKα1及其突变体在小鼠卵母细胞中的超表达呈聚集分布,并与减数分裂过程中的染色质分离相关联.与对照组相比,除超表达AMPKα1-S485A组之外,其余各组的超表达都加速了小鼠卵母细胞的成熟进程,而超表达AMPKα1-S485A突变体的卵母细胞生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率与对照组相比无显著差异,且增加了卵母细胞的极体排出率以及降低了卵母细胞的死亡率.以上结果表明,AMPKα1在小鼠卵母细胞成熟过程发挥着重要作用,为其后续在卵母细胞中的作用研究提供了参考.
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