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【摘要】目的：观察关节内注射参麦注射液治疗家兔膝骨关节炎的疗效。方法：以40只健康SPF级新西兰家兔为研究对象，随机分为正常对照组、模型组、参麦注射液组（以下称参麦组）、利多卡因组和参麦注射液+利多卡因组（以下称参麦+利多组）5组，每组8只，除正常对照组外，其余4组采用木瓜蛋白酶所致兔膝骨关节炎模型。正常对照组、模型组分别予关节内注射0.4 mL的注射用生理盐水，参麦组注射0.4 mL参麦注射液，利多卡因组注射0.4 mL利多卡因，参麦+利多组注射二者混合液0.4 mL，每周1次，连续8次，观察家兔步态、膝关节周径及关节液中炎症因子浓度。结果：造模后2周家兔步态除正常对照组外，其余4组造模前后步态均有明显变化（P=0.018 < 0.05），参麦组与参麦+利多组给药4次后步态与造模前无明显差异（P = 0.021、0.012 < 0.05）；给药8次后膝关节周径变化与正常对照组比较，模型组膝关节周长增大，差异有统计学意义（P = 0.0049 < 0.05），参麦组有所增大，差异无统计学意义（P = 0.13 > 0.05），利多卡因组明显增大，差异有统计学意义（P = 0.029 < 0.05），参麦+利多组减小，但差异无统计学意义（P = 0.77 > 0.05）；局部炎症因子水平结果与正常对照组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高，差异有统计学意义（P = 0.023，0.001，0.014 < 0.05），参麦组有所升高，差异无统计学意义（P = 0.061，0.13，0.527 > 0.05），利多卡因组明显升高，差异有统计学意义（P = 0.031，0.008，0.025 < 0.05），参麦+利多组有所升高，但差异无统计学意义（P = 0.087，0.17，0.18 > 0.05）。结论：关节内注射参麦注射液能明显改善模型兔步态，消除膝关节肿胀，同时可以降低关节液的炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
【关键词】 骨关节炎，膝；参麦注射液；关节内注射治疗；实验研究；家兔；实验研究
退行性膝关节病（degenerative osteoarthritis， DOA）是临床上的常见病、多发病之一，其特点为关节软骨退化、变性和坏死，并在软骨下骨及关节周围有新骨形成[1-3]。DOA多发于中老年人，随着年龄的增长，加之长期负重或过度使用，导致关节软骨的退变。关节软骨、骨骼的退变与机体其他组织（如心血管）退变有相似性，研究者从参麦注射液有营养心肌细胞的作用得到启示[1，6]，利用膝关节腔注射给药的方式，以达到直接营养关节软骨的目的。为探讨参麦注射液防治膝关节退行性疾病的作用机制及局部用药的安全性，探索防治DOA新思路，笔者于2011年12月开展本研究，现总结报道如下。
1 实验材料
1.1 实验动物 健康SPF级新西兰家兔40只，由广东省医学动物实验中心提供，实验动物合格证号SCXK（粤）2011-0062。
1.2 实验药品及试剂 参麦注射液（四川三精升和制药有限公司生产，国药准字Z20053254，生产批号110914）每支10 mL；利多卡因注射液（江苏济川制药有限公司生产，生产批号110315）每支5 mL；
木瓜蛋白酶（活力200万U，天津诺奥科技发展有限公司提供）；IL-1β、IL-6、TNF（广州展晨生物科技有限公司，生产批号CK-E30015）。
2 方 法
2.1 造模与分组 40只家兔适应性喂养1周后，随机取8只为正常对照组，给予关节腔内注射0.5 mL
EDTANa2磷酸盐缓冲液，其余家兔采用木瓜蛋白酶所致兔骨关节炎造模：将NaCl 0.4 g、NaOH 0.01 g、Na2HPO4 0.358 g及KH2PO4 0.024 g溶解在8 mL双蒸水中，加入NaOH调节pH值至8.0，加入EDTANa2 7.44 mg，震荡溶解，再加入木瓜蛋白酶0.16 g溶解，测量液体pH值后，加入HCL调整pH值到6.5，以双蒸水定容至10 mL，4 ℃低温保存备用。将上述备用的1.60%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL
注入动物双侧膝关节腔内，第l，3，7天各注射1次。根据临床上超疲劳容易提前出现骨关节炎的发病特点，每日强迫家兔活动30 min，2周后即得到稳定的膝骨关节炎模型。造模成功后随机分为模型组、参麦组、利多卡因组、参麦+利多组4组，每组8只。
2.2 给药方法 造模2周后，参麦组关节腔注射参麦注射液0.4 mL（2 mg·kg-1）、利多卡因组关节腔注射利多卡因注射液0.4 mL（2 mg·kg-1）和参麦+利多组注射0.4 mL参麦注射液和利多卡因注射液混合液，正常对照组和模型组均关节腔内注射0.4 mL的注射用生理盐水，每周1次，连续8次，于未次注射给药后2 h，取血，不加抗凝剂，然后处死家兔。
2.3 观察指标
2.3.1 家兔步态的评价 分别于造模前后、给药期、末次给药2 h，每日观察，每4周进行1次步态评价，步态分级按Coderre的方法，即0级：正常行走；I级：轻微跛行，受试下肢略有弯曲；Ⅱ级：中度跛行，受试下肢刚触及地面；Ⅲ级：重度跛行，受试下肢略离开地面，后足着地行走。
2.3.2 膝关节周长测量 分别于造模前后、给药期、末次给药2 h，麻醉，用软尺测量各组动物膝关节部位周长，计算肿胀率后进行统计。
2.3.3 关节液炎症因子浓度测定
2.3.3.1 标本取材 处死家兔仰卧位固定，于膝关节处剃毛，常规消毒、铺巾，切开皮肤，暴露关节囊，用无菌注射器抽取2 mL无菌生理盐水，进行关节腔灌注，屈伸活动膝关节5次，反复抽出注入5次。待关节液与生理盐水混匀后，收集全部关节腔灌注液，测量关节液量，以所测关节液减去2 mL无菌生理盐水作为关节液容量，-80 ℃保存备用。 2.3.3.2 关节液组织炎症因子浓度测定 取所有动物关节液1 000 r·min-1离心5 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱，测白细胞计数，ELISA双抗夹心法测IL-1β、IL-6、TNF浓度。
2.4 统计学方法 数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析，方差齐，采用LSD方法进行两两比较，方差不齐，采用Tamhane方法进行两两比较；等级资料采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 家兔步态情况 经秩和检验，除正常对照组外，其余4组造模前后步态变化，差异均有统计学意义，（P = 0.018 < 0.05）；与正常对照组比较，其余4组造模后步态变化，差异均有统计学意义（P = 0.022 < 0.05），见表1。
3.2 膝关节肿胀情况 见表2。
3.3 关节液炎症因子浓度测定 见表3。
4 讨 论
膝骨关节炎以关节软骨的退变为主要病理特征。近年来，随着世界老龄化人口的日益增加，KOA的发病率在全球范围内都呈逐年上升趋势，因而如何预防与治疗KOA已经成为各国骨科学界研究者面临的重要课题。细胞因子在KOA病理改变过程中起重要作用，大量研究显示，细胞因子是骨关节炎软骨组织炎性破坏降解的重要介质，不仅协同抑制软骨组织成分的合成，同时参与软骨组织的破坏分解[4]。研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子在KOA发生发展中也发挥了重要作用，能特异地作用于软骨细胞及滑膜细胞，参与调节基质金属蛋白酶的形成，抑制胶原蛋白和蛋白多糖的合成，介导关节软骨的破坏[5-7]。本研究中采用兔膝关节内注射木瓜蛋白酶的方法复制KOA模型，注射2周时采用Lequesne的膝关节评估级别中的关节局部反应、关节畸形情况对模型进行严格评价，结果显示，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；对KOA局部肿胀程度进行观察，与正常对照组比较，发现关节肿胀明显，与KOA变化相同。
KOA属中医学“骨痹”范畴，多为正气虚弱，复感外邪，闭阻经络而发病。一般认为KOA的病理机制是人体关节内应力平衡失调，失调的原因是细胞因子造成了关节软骨降解，加之关节周围软组织挛缩、粘连，且长期得不到纠正所致[8-9]。
关节内注射参麦注射液能明显改善兔的步态异常；模型组关节液IL-1β含量与正常对照组比较明显升高，说明兔关节液中IL-1β是KOA病理改变的一种重要炎症介质。参麦注射液关节内注射治疗后，兔关节液中IL-1β含量与型组比较有减少，与正常对照组比较仍然偏高，差异无统计学意义（P > 0.05），且关节软骨组织形态较模型组有所改善，说明参麦注射液关节内注射疗法对KOA进程中细胞因子IL-1β的生成具有一定的拮抗作用。我们在兔KOA模型制备成功后，进行参麦注射液关节内注射治疗后8周发现模型组兔关节液中IL-6、TNF-α含量与正常对照组比较明显升高（P < 0.05），说明参麦注射液关节内注射疗法可以减轻局部的炎症反应。
本研究结果显示，参麦注射液关节内注射能够改善模型兔的步态、消除膝关节肿胀，同时可以降低局部组织的炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α水平，该治疗方法的安全有效性，值得临床进一步深入研究。
5 参考文献
[1] 黄剑，卓廉士，彭支莲，等.电针对家兔膝骨关节炎模型关节液中IL-lB、IL-6和TNF-α的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2007，15（3）：17-21.
[2] 汤晓晨，俞峰，孙书龙，等.黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨IL-1β表达的影响[J].南京中医药大学学报，2013，29（1）：48-52.
[3] 潘海乐，姚跃，王国文，等.骨性关节炎模型动物血液、关节液中IL-I水平检测[J].哈尔滨医科大学学报，2001，35（3）：192-194.
[4] Fernanndes JC，Martel-Pelletier J，Pelhtier JP.The roleof cytokines in osteoarthritis pathophysiology[J].Biorheology，2002，39（1/2）：237-246.
[5] 蒋云霞，胡志俊，唐占英，等.益气化瘀补肾方对兔膝骨关节炎关节软骨细胞胶原和基质金属蛋白酶mRNA表达的影响[J].上海中医药大学学报，2013，27（1）：74-77.
[6] 廖怀章，游叶平，何乐善，等.膝骨痹康胶囊对膝骨关节炎大鼠肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1的影响[J].中医正骨，2011，23（10）：3-6.
[7] 汤剑斌，圣小平，樊天佑.电针治疗对膝骨关节炎兔膝关节软骨细胞凋亡的影响[J].中医正骨，2012，24（4）：12-15.
[8] 郝一勇，卫小春.膝关节液透明质酸含量与关节软骨损伤的关系[J].中国骨伤，2004，17（6）：321-324.
[9] 王国文，潘海乐，曲波，等.参麦注射液对骨关节炎模型动物关节软骨胶原含量的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2001，9（2）：14-16.
【关键词】 骨关节炎，膝；参麦注射液；关节内注射治疗；实验研究；家兔；实验研究
退行性膝关节病（degenerative osteoarthritis， DOA）是临床上的常见病、多发病之一，其特点为关节软骨退化、变性和坏死，并在软骨下骨及关节周围有新骨形成[1-3]。DOA多发于中老年人，随着年龄的增长，加之长期负重或过度使用，导致关节软骨的退变。关节软骨、骨骼的退变与机体其他组织（如心血管）退变有相似性，研究者从参麦注射液有营养心肌细胞的作用得到启示[1，6]，利用膝关节腔注射给药的方式，以达到直接营养关节软骨的目的。为探讨参麦注射液防治膝关节退行性疾病的作用机制及局部用药的安全性，探索防治DOA新思路，笔者于2011年12月开展本研究，现总结报道如下。
1 实验材料
1.1 实验动物 健康SPF级新西兰家兔40只，由广东省医学动物实验中心提供，实验动物合格证号SCXK（粤）2011-0062。
1.2 实验药品及试剂 参麦注射液（四川三精升和制药有限公司生产，国药准字Z20053254，生产批号110914）每支10 mL；利多卡因注射液（江苏济川制药有限公司生产，生产批号110315）每支5 mL；
木瓜蛋白酶（活力200万U，天津诺奥科技发展有限公司提供）；IL-1β、IL-6、TNF（广州展晨生物科技有限公司，生产批号CK-E30015）。
2 方 法
2.1 造模与分组 40只家兔适应性喂养1周后，随机取8只为正常对照组，给予关节腔内注射0.5 mL
EDTANa2磷酸盐缓冲液，其余家兔采用木瓜蛋白酶所致兔骨关节炎造模：将NaCl 0.4 g、NaOH 0.01 g、Na2HPO4 0.358 g及KH2PO4 0.024 g溶解在8 mL双蒸水中，加入NaOH调节pH值至8.0，加入EDTANa2 7.44 mg，震荡溶解，再加入木瓜蛋白酶0.16 g溶解，测量液体pH值后，加入HCL调整pH值到6.5，以双蒸水定容至10 mL，4 ℃低温保存备用。将上述备用的1.60%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL
注入动物双侧膝关节腔内，第l，3，7天各注射1次。根据临床上超疲劳容易提前出现骨关节炎的发病特点，每日强迫家兔活动30 min，2周后即得到稳定的膝骨关节炎模型。造模成功后随机分为模型组、参麦组、利多卡因组、参麦+利多组4组，每组8只。
2.2 给药方法 造模2周后，参麦组关节腔注射参麦注射液0.4 mL（2 mg·kg-1）、利多卡因组关节腔注射利多卡因注射液0.4 mL（2 mg·kg-1）和参麦+利多组注射0.4 mL参麦注射液和利多卡因注射液混合液，正常对照组和模型组均关节腔内注射0.4 mL的注射用生理盐水，每周1次，连续8次，于未次注射给药后2 h，取血，不加抗凝剂，然后处死家兔。
2.3 观察指标
2.3.1 家兔步态的评价 分别于造模前后、给药期、末次给药2 h，每日观察，每4周进行1次步态评价，步态分级按Coderre的方法，即0级：正常行走；I级：轻微跛行，受试下肢略有弯曲；Ⅱ级：中度跛行，受试下肢刚触及地面；Ⅲ级：重度跛行，受试下肢略离开地面，后足着地行走。
2.3.2 膝关节周长测量 分别于造模前后、给药期、末次给药2 h，麻醉，用软尺测量各组动物膝关节部位周长，计算肿胀率后进行统计。
2.3.3 关节液炎症因子浓度测定
2.3.3.1 标本取材 处死家兔仰卧位固定，于膝关节处剃毛，常规消毒、铺巾，切开皮肤，暴露关节囊，用无菌注射器抽取2 mL无菌生理盐水，进行关节腔灌注，屈伸活动膝关节5次，反复抽出注入5次。待关节液与生理盐水混匀后，收集全部关节腔灌注液，测量关节液量，以所测关节液减去2 mL无菌生理盐水作为关节液容量，-80 ℃保存备用。 2.3.3.2 关节液组织炎症因子浓度测定 取所有动物关节液1 000 r·min-1离心5 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱，测白细胞计数，ELISA双抗夹心法测IL-1β、IL-6、TNF浓度。
2.4 统计学方法 数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以表示，采用单因素方差分析，方差齐，采用LSD方法进行两两比较，方差不齐，采用Tamhane方法进行两两比较；等级资料采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 家兔步态情况 经秩和检验，除正常对照组外，其余4组造模前后步态变化，差异均有统计学意义，（P = 0.018 < 0.05）；与正常对照组比较，其余4组造模后步态变化，差异均有统计学意义（P = 0.022 < 0.05），见表1。
3.2 膝关节肿胀情况 见表2。
3.3 关节液炎症因子浓度测定 见表3。
4 讨 论
膝骨关节炎以关节软骨的退变为主要病理特征。近年来，随着世界老龄化人口的日益增加，KOA的发病率在全球范围内都呈逐年上升趋势，因而如何预防与治疗KOA已经成为各国骨科学界研究者面临的重要课题。细胞因子在KOA病理改变过程中起重要作用，大量研究显示，细胞因子是骨关节炎软骨组织炎性破坏降解的重要介质，不仅协同抑制软骨组织成分的合成，同时参与软骨组织的破坏分解[4]。研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子在KOA发生发展中也发挥了重要作用，能特异地作用于软骨细胞及滑膜细胞，参与调节基质金属蛋白酶的形成，抑制胶原蛋白和蛋白多糖的合成，介导关节软骨的破坏[5-7]。本研究中采用兔膝关节内注射木瓜蛋白酶的方法复制KOA模型，注射2周时采用Lequesne的膝关节评估级别中的关节局部反应、关节畸形情况对模型进行严格评价，结果显示，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；对KOA局部肿胀程度进行观察，与正常对照组比较，发现关节肿胀明显，与KOA变化相同。
KOA属中医学“骨痹”范畴，多为正气虚弱，复感外邪，闭阻经络而发病。一般认为KOA的病理机制是人体关节内应力平衡失调，失调的原因是细胞因子造成了关节软骨降解，加之关节周围软组织挛缩、粘连，且长期得不到纠正所致[8-9]。
关节内注射参麦注射液能明显改善兔的步态异常；模型组关节液IL-1β含量与正常对照组比较明显升高，说明兔关节液中IL-1β是KOA病理改变的一种重要炎症介质。参麦注射液关节内注射治疗后，兔关节液中IL-1β含量与型组比较有减少，与正常对照组比较仍然偏高，差异无统计学意义（P > 0.05），且关节软骨组织形态较模型组有所改善，说明参麦注射液关节内注射疗法对KOA进程中细胞因子IL-1β的生成具有一定的拮抗作用。我们在兔KOA模型制备成功后，进行参麦注射液关节内注射治疗后8周发现模型组兔关节液中IL-6、TNF-α含量与正常对照组比较明显升高（P < 0.05），说明参麦注射液关节内注射疗法可以减轻局部的炎症反应。
本研究结果显示，参麦注射液关节内注射能够改善模型兔的步态、消除膝关节肿胀，同时可以降低局部组织的炎症因子如IL-1β、IL-6、TNF-α水平，该治疗方法的安全有效性，值得临床进一步深入研究。
5 参考文献
[1] 黄剑，卓廉士，彭支莲，等.电针对家兔膝骨关节炎模型关节液中IL-lB、IL-6和TNF-α的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2007，15（3）：17-21.
[2] 汤晓晨，俞峰，孙书龙，等.黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变关节软骨IL-1β表达的影响[J].南京中医药大学学报，2013，29（1）：48-52.
[3] 潘海乐，姚跃，王国文，等.骨性关节炎模型动物血液、关节液中IL-I水平检测[J].哈尔滨医科大学学报，2001，35（3）：192-194.
[4] Fernanndes JC，Martel-Pelletier J，Pelhtier JP.The roleof cytokines in osteoarthritis pathophysiology[J].Biorheology，2002，39（1/2）：237-246.
[5] 蒋云霞，胡志俊，唐占英，等.益气化瘀补肾方对兔膝骨关节炎关节软骨细胞胶原和基质金属蛋白酶mRNA表达的影响[J].上海中医药大学学报，2013，27（1）：74-77.
[6] 廖怀章，游叶平，何乐善，等.膝骨痹康胶囊对膝骨关节炎大鼠肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1的影响[J].中医正骨，2011，23（10）：3-6.
[7] 汤剑斌，圣小平，樊天佑.电针治疗对膝骨关节炎兔膝关节软骨细胞凋亡的影响[J].中医正骨，2012，24（4）：12-15.
[8] 郝一勇，卫小春.膝关节液透明质酸含量与关节软骨损伤的关系[J].中国骨伤，2004，17（6）：321-324.
[9] 王国文，潘海乐，曲波，等.参麦注射液对骨关节炎模型动物关节软骨胶原含量的影响[J].中国中医骨伤科杂志，2001，9（2）：14-16.