【摘 要】
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目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包
【机 构】
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目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统。
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