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摘 要:GC-MS技术检测灵敏度高,分离效能好,使之在中药研究领域的应用越来越受到重视。在化学成分分析方面广泛应用于挥发油、生物碱、糖类、脂肪酸类、甾类化合物分析, 在未知成分的鉴定、有效成分分析测定、药效及药动等方面也多有研究。GC-MS是优化生产工艺、建立中药质量控制标准、提高中药复方的质量水平的有效手段之一。
关键词:GC-MS;中药;质量控制
中图分类号:TQ
文献标识码:A
文章编号:1672-3198(2010)09-0362-03
气相色谱法(Gas chromatography,GC)是近年来应用日趋广泛的分析技术,特别适用于具有挥发性的复杂组分的分离、分析,由于是以气体作为流动相,所以传质速度快,一般的样品分析可在20-30s左右完成,具有分离效能高,灵敏度高的特点,在有对照品的条件下,可作定性、定量分析,但对重大事件或有争议的样品不能做出肯定鉴定报告,必须连接如质谱的检测器。另外对于不能气化的样品则需要作衍生化处理后再分析。质谱(Mass Spectrnum,MS)是强有力的结构解析工具,能为结构定性提供较多的信息,是理想的色谱检测器。气相色谱-质谱(GC-MS)联用利用了色谱的高分离能力和质谱的高鉴别特性,可对复杂的混合样品进行分离、定性、定量分析的一次完成,是一种完美的现代分析方法。GC-MS的常用测定方法:总离子流色谱法(total ionization chromatography,TIC)—— 类似于GC 图谱,用于定量。反复扫描法(repetitive scanning method,RSM)——按一定间隔时间反复扫描,自动测量、运算,制得各个组分的质谱图,可进行定性。质量色谱法(mass chromatography,MC)——记录具有某质荷比的离子强度随时间变化图谱。在选定的质量范围内,任何一个质量数都有与总离子流色谱图相似的质量色谱图。GC-MS技术随着仪器的不断完善与发展,检测技术的成熟与推广,其应用范围越来越广。由于GC-MS技术检测灵敏度高,分离效能好,使之在中药研究领域的应用越来越受到重视。在挥发油、生物碱、糖类、脂肪酸类、甾类化合物分析方面均有广泛应用。在质量控制方面GC-MS也得到了越来越广泛的应用。
1 化学成分研究
中药是经过炮制的各类饮片和按照四气五味、君臣佐使等特性与法则配比而成的方剂药物,其化学成分复杂且含量差异大,一种仪器的使用往往很难得到准确结果,GC-MS利用了色谱的高分离能力和质谱的高鉴别特性可以快速得到准确结果。
1.1 挥发油分析
GC-MS以其高分辨率、高灵敏度和简便准确的特点,成为挥发油分析中最常使用的分析方法。
1.1.1 中药材及中药未知成分的鉴定
王少军等用水蒸气蒸馏法从豆蔻中提取挥发油,用归一化法测定各组分的相对百分含量,并用气相色谱-质谱法对其化学成分进行鉴定,共鉴定了71个成分,占挥发油总成分的89%以上。气相色谱分析条件:色谱柱为ULTKA22 (50 m ×0. 20 mm ×0. 25μm)弹性石英毛细管柱;进样口温度220°C;接口温度250°C;载气为氦气,流速0. 9 mL•min-1;分流比60∶1;进样量0.8μL;升温程序:柱温60 °C,保持1 min,以10°C/min升至100 °C,保持2min,再4°C/min升至200°C,保持3min,再20°C/min升至320 °C。质谱条件:电离方式EI,电子轰击能量70 ev,离子源温度230°C,加速电压34.6V,分辨率2500,扫描范围30～350aum,倍增器电压1341 v,N IST298标准质谱图库。
朱缨用气相色谱-质谱法对江苏产蛇床子挥发油化学成分进行分析,用水蒸气蒸馏法从蛇床子挥发油中提取挥发油,研究其分离分析的条件,对分离的物质用GC-MS鉴定,归一法确定其相对百分含量,鉴定了27个主要成分。
童星用气相色谱-质谱联用技术测定了最佳提取条件下所得常春藤挥发油的化学成分及其相对质量分数,共分离出30种成分并鉴定出其中21种,主要是萜烯类化合物以及环氧衍生物(33.17%),邻苯二甲酸异丁基酯(18.89%),氧化石竹烯(15.10%),花生酸(13.65%),香紫苏内酯(6.17%),匙叶桉油烯醇(4.77%),葎草烯(2.49%),α-石竹萜烯(1.41%)。说明GC-MS稳定可靠,重现性好,适用于中药挥发油的化学成分分析。
1.1.2 中药有效成分分析测定
钦旦新等使用GC-MS法,对缅甸产樟属两种植物cinnamomun multiflorum,C.bejolghota(钝叶桂)茎皮与中药肉桂(C.cassis)这3种植物的乙醚提取物进行定性、定量分析,根据IR及MS图谱对所含化合物进行鉴别,根据峰面积计算化合物的相对含量,结果表明在鉴定的62个化合物中,C.multiflorum的主要成分为单萜及其衍生物(53.18%),其中桂皮醛的含量(29.57%)甚至高于肉桂(22.36%),C.bejolghota的主要成分为倍半萜及其衍生物(58.18%),其中丁香酚含量为三者最高。明确了C.multiflorum与C.bejolghota的挥发性、半挥发性成分的化学组成,提示C.multiflorum、C.bejolghota可作为肉桂的代用品。对中药有效成分测定可为寻找稀缺药材代用品提供线索。
对中药有效成分测定可为探索中药配伍提供线索。如魏凤环等建立气相色谱 -质谱法 (GC- MS)测定麻黄汤中桂皮醛含量的方法,研究配伍对桂皮醛含量的影响。采用GC- MS法测定桂皮醛的含量,并用 MS鉴定其他色谱峰,用 L8(2 7)正交设计安排试验,统计软件(SPSS10.0 )分析麻黄、杏仁、甘草及两两交互作用对桂皮醛含量的影响,p H计测定各组合的 p H值。结果表明麻黄、杏仁显著降低桂皮醛的含量 ,甘草及交互作用则对其含量的降低无统计学意义。色谱/质谱条件: 色谱柱: HP-5 弹性石英毛细管(30 mm ×0.5 mm ×0.25 mm ), 进样量: 1μL ,无分流进样, 进样口温度: 220℃, 载气: He, 载气为恒流模式,柱流量: 110mL/m in。柱初温: 120℃,以8℃/m in 升至250℃,接口温度: 280℃,离子源:EI,电离能量: 70eV ,倍增电压: 1675 V。
李吉来等建立麻黄汤煎液中麻黄碱与伪麻黄碱的GC-MS定量方法,测定麻黄汤及麻黄与其它各味中药配伍后构成的组方中麻黄碱与伪麻黄碱的煎出量,并考查其煎出量的变化,GC-MS选用特征离子定量法进行测定。结果麻黄单煎液中麻黄碱与伪麻黄碱的溶出量较与杏仁合煎液中显著减少,较与桂枝合煎液中显著增多,较与甘草合煎液中无明显变化。说明该法准确、可靠,可作为麻黄汤中麻黄碱与伪麻黄碱的定量方法 。
1.1.3 药效及药动研究
贺丰等用GC-MS法测定麻黄碱(ephedrine,E)、伪麻黄碱(pseudoephedrine,PE)人血藥浓度,所得数据用WinNonlin4.0.1药代动力学程序处理,求出有关参数,E、PE分别在5～1000ng/mL,2.5～500ng/mL的范围内线性关系良好(r2=0.9985,r2=0.9994),加样回收率分别为107.5%～96.2%,102.5%～93.9%,两者日内、日间精密度的RSD<5%,血浆样品60d内稳定,符合生物样本分析要求,表明GC-MS稳定、准确,灵敏度高,适于E、PE的血药浓度测定。
曹兴华建立气相色谱-质谱(GC-MS)法测定异丙酚血浆药物浓度的方法学,为研究异丙酚的药代-药效动力学提供科学的分析技术。气相色谱(GC)的色谱柱为HP-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm),载气为高纯氦(99.999%),柱流量为1ml•min～(-1),进样口压力为7.99p.s.i,进样口温度为240℃,进样方式为手动无分流进样,进样量为1.0μl。程序升温,起始55℃维持1min,以20℃/min速度升至150℃,维持3min,共运行8.75min。质谱(MS)为电离方式EI,电子能量70ev,接口温度280℃,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,选择离子采集(SIM)。用于异丙酚和麝香草酚定性的检测离子分别为:异丙酚碎片离子m/z为163、分子离子m/z为178;麝香草酚碎片离子m/z为135、分子离子m/Z为150;异丙酚与内标物峰面积的比值作为定量参数。
1.2 生物碱分析
生物碱是源自动植物机体内的具有强烈生理效能的碱性物质,其结构比较复杂,分子极性相差较大,常用GC-MS分析,具有不需标准品的优点。
朱全红等建立 GC-MS 测定麻黄汤代谢产物麻黄类生物碱浓度的方法。方法:尿样经5 mol•L～(-1)氢氧化钾碱化后,用乙酸乙酯萃取。以二苯胺为内标,采用 GC-MS 分离并同时测定了人体口服麻黄汤后尿中5种麻黄碱的浓度,检测方式为选择离子(m/z 44,m/z 58,m/z 72,m/z 169),色谱条件:色谱柱为 DB-5MS 毛细管柱(30 m×250μm,0.25μm),载气为 He(1 mL•min～(-1)),无分流进样,进样量1μL。起始温度70℃(1 min)125℃(5min)270℃(5 min)。用该方法测定6名健康志愿者单次口服麻黄汤后尿液中麻黄碱类代谢产物的浓度,在24 min 内去甲伪麻黄碱(NMP)、去甲麻黄碱(NME)、麻黄碱(E)、伪麻黄碱(PE)和甲基麻黄碱(ME)达到良好分离,五种麻黄类生物碱的回收率均在88.74%-102.70%之间,日内和日间精密度均10%。表明GC-MS简单、灵敏、准确,重复性好,可用于麻黄中药复方代谢产物麻黄类生物碱的测定。
赵宝玉等采用GC-MS联用技术从牛心朴子的全草中分离鉴定出12种生物碱,分别为2,4,6-三甲基吡啶;2,6-二乙基吡啶;4-(1-哌啶)-2-丁酮;苯并噻唑;3-正丙基-2,6-二苯基吡啶;娃儿藤定碱;2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮;Diazen,butyl[1-(2,2-dimethylhydr)];5,10-Diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a;1`,2`-d]pyrazine;9-Azabicyclo[3,3,1]nonane,9-methyl-;Piperidino[2,3-b]2,3-dihtdroindene,1-methyl-4,4a-diethyl-6-methyl-;7,14-Methano-4H,6H-dipyrido[1,2-a:1`,2`-E][1,5]diazocin-4-one,7,7a,8,9,10,11,13,14-oc-tahydro-,[7R-(7,alpha,7a,alpha,14,alpha)]。其中后6种为首次从该植物中分得。表明GC-MS可用于对牛心朴子的全草生物碱分离。
1.3 脂溶性成分分析
张小燕等采用气质联用技术对中药麦冬的三氯甲烷部位进行化学成分分析,通过质谱棒图分析及NIST98谱库检索,确定了气质联用分析条件,从麦冬块根的三氯甲烷部位测得32个脂溶性成分。表明GC-MS解析了麦冬低极性部位的化学成分,为全面反映麦冬的化学成分提供依据。
洪永福等采用气相色谱-质谱(GC-MS)从 3种木瓜的乙醚提取部位中首次分离与鉴定出61个化合物,其中皱皮木瓜 (Chaenomeles lagenaria)40个化合物,宣木瓜 (C.lagenaria产自安徽宣州) 34个化合物,光皮木瓜 (C.sinensis) 23个化合物。有10个化合物在 3種木瓜中都含有,但相对含量差别大。它们是乙酸、苯甲醛、正葵酸、14-甲基十五烷酸甲酯、丙三醇、苯甲酸、6,9-十八碳二烯酸甲酯、角鲨烷、硬脂酸和二十烷基油酸酯。表明GC-MS解析了3种木瓜低极性部位的化学成分,为全面反映木瓜的化学成分提供依据。
丁旭光等以石油醚为溶剂,采用索氏提取法提取中药木鳖子中脂肪酸,经甲酯化处理后,用GC-MS联用仪对中药木鳖子中脂肪酸组成进行了分析和鉴定共分离出14种脂肪酸,占脂肪酸总量的89.23%。
刘君等采用GC-MS法分析了中药蚂蟥脂肪酸的组成,鉴定了19个组分,其中不饱和脂肪酸占71.84%,饱和脂肪酸占20.71%。
文震等利用气相色谱-质谱 (GC-MS) 联用,对两种常见海洋中药粗吻海龙 ( Trachyrhaphus serratus ) 与多棘海星 ( Asterias amurensis ) 中的甾醇化合物进行了分析。经鉴定,海龙的甾醇成分主要为胆甾醇类,海星甾醇主要为△7-脱氢胆甾醇、麦角甾醇与豆甾醇类化合物。
1.4 糖类化合物分析
糖类化合物是多数中草药中的成分,糖分为单糖、寡糖和多糖。质谱由于选择性良好、灵敏度高、专一性强,传统的GC-MS一直是糖类衍生物痕量分析选择的方法。由于糖类本身没有足够的挥发性,必须将其转化为挥发性衍生物才能进行GC-MS分析;多糖要首先降解为单糖或简单的寡糖然后衍生。
郭方遒等采用红外、气质联用技术分析了枸杞水溶性多糖中单糖组成及其含量。结果表明,枸杞多糖里含有的单糖包括阿拉伯糖,鼠李糖,木糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,其含量比例为13.19∶3.41∶2.92∶10.53∶18.92∶9.82。
周斌等对烟草中的糖类用水超声提取,用C18SPE柱预分离,衍生化后用GC-MS分析测定。结果表明,方法的检出限范围是4.7～7.6 ng,加标回收率为96%～106%,相对标准偏差(RSD)为4.63%～6.06%。实验证明GC-MS分析烟草中的糖类具有较高的准确度、快速和简便的特点。
2 质量控制研究
2.1 中药指纹图谱研究
中药指纹图谱是一种综合的量化的色谱鉴别手段,以达到鉴别真伪、评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性为目的。中药指纹图谱技术能够有效鉴别样品的真伪或产地,能够有效控制中药及复方样品的质量,能确保中药产品及复方制剂质量的相对稳定。因此,在有效成分不完全明确的前提下,测定中药材或中成药的特征指纹图谱具有重大的意义。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段。
气相色谱质谱联用(GC-MS)技术作为中药指纹图谱研究的先进手段之一,日益走向技术应用的前台。一般而言,中药挥发油大多含有几十到一百个成分,且这些成分随药材品种、产地、采收时节、炮制方法等不同在很大程度上也会发生变化。挥发油虽然所含成分数量不少,但其实都有为数不多(几个到十几个)的特征性成分,以这些含量大、为数不太多的特征指标成分群开展挥发油指纹图谱的研究,切实可行、简便实用。
魏刚探讨GC-MS建立中药特征指纹图谱色谱条件的参数设置,在石菖蒲、广藿香等实例研究的基础上,对溶剂的种类和数量,以及升温程序、电离电压、柱前压与流速、离子源温度、进样口温度等仪器参数进行比较,结果升温程序、电离电压、柱前压与流速等对特征指纹图谱的影响较大,而离子源温度、进样口温度的影响较小,表明用GC-MS建立中药特征指纹图谱方法先进、可靠。
魏刚采用GC-MS制定了麝香芳香水中麝香酮的含量限度, 同时建立了石菖蒲挥发油的特征指纹图谱,麝香芳香水中麝香酮可控制在 0 .16 6～ 0 .2 0 2mg/mL之间,3批成品麝香酮含量差异RSD =4.49%,不超过10 % ,以甲基丁香酚、顺式甲基异丁香酚、反式甲基异丁香酚、榄香素、β-细辛醚、α-细辛醚 6个主要成分的出峰先后顺序及其相对含量为特征构成了石菖蒲挥发油的特征指纹图谱,以上特征在成品中可以重复。
欧阳臻等用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析不同产地17个茅苍术样品,研究茅苍术挥发油的指纹图谱,为茅苍术的内在质量评价和鉴定提供特征性数据。采用"中药指纹图谱相似性计算"软件进行模式分析及相似度计算并进行SPSS聚类分析;建立道地茅苍术的特征指纹图谱并研究有效成分之间的配比。建立了5批道地茅苍术的共有指纹图谱模式,挥发油中苍术酮、茅术醇、β-桉叶醇和苍术素4种有效成分呈一特定的配比关系,即(0.89～1.12)∶(0.11～0.15)∶(0.48～0.61)∶1;相似度计算结果表明不同产地茅苍术与道地的相比差异明显;聚类分析结果可分为2大类,道地产区可与江苏汤山的和江苏南山的聚为一类,安徽和湖北的聚为一类。茅苍术指纹图谱的建立和有效成分配比关系分析结合聚类分析的方法可用于茅苍术质量控制,为全面有效评价茅苍术质量提供可靠依据。
2.2 生产工艺研究
中药指纹图谱必将成为中药质量评价的发展趋势,规范、标准的中药指纹图谱的实施,将会有力地促进实现中药现代化的进程。原料药材质量的提高和稳定是制剂指纹图谱能否成功建立的首要问题;生产工艺的规范和优化是研究实施指纹图谱的另一个重要环节。GC-MS在生产工艺研究上的应用加快了质量控制的规范化进程并且作为指纹图谱的一个环节促进指纹图谱研究发展从而进一步规范质量控制。
曾经考等采用GC -MS对加味苍耳子散、清上祛痛胶囊、肠炎灵片、健中疡愈片等复方制剂挥发油进行分析,结果发现单味药挥发油的特征成分或主要成分基本能从复方挥发油中检出;而在一些成品中仅检出脂肪酸类挥发性成分,表明其制剂工艺未对挥发油进行收集或挥发油损失过多,有待改进。研究结果表明GC-MS可广泛应用于中药复方制剂挥发油的工艺研究与质量控制 。
魏刚等采用GC-MS对加味苍耳子散组方中每味药材所含挥发油的主要成分进行追踪,确定加味苍耳子散挥发油提取工艺为:辛夷、丹皮粉碎成粗粉,合并薄荷采用水蒸气蒸餾法提油,收集 13倍的初蒸馏液,再收集3倍量的重蒸馏液;川芎挥发油采用醇提;苍耳子、白芷含挥发油很少,同时为避免苍耳子水提产生毒性及白芷香豆素类成分遭破坏,其油不予提取。表明GC-MS是追踪优化中药复方挥发油提取工艺的强有力工具,值得推广。
3 结语
GC-MS结合GC的高柱效、高分离性能与MS的定性功能,对挥发性未知成分与微量成分的结构确定有独到之处。在化学成分分析方面不仅广泛应用于挥发油分析还由于其不需要标准品的优点与HPLC、TLC等共同用于生物碱分析,还可用于糖类和脂肪酸类的衍生化后分析。
在中药现代化越来越成为中药发展的关键步骤的今天,对中药质量控制的规范化提出了越来越高的要求。GC-MS在指纹图谱研究和生产工艺控制方面起着不可或缺的作用。采用GC-MS制定了有效成分含量限度,以主要成分的出峰先后顺序及其相对含量为特征构成了中药的特征指纹图谱,以上特征在成品中可以重复。GC-MS是优化生产工艺、建立中药质量控制标准、提高中药复方的质量水平的有效手段之一。
由于中药成分的复杂性使得GC-MS的应用具有一定的局限性,往往难以提供精确的结构信息,随着应用范围的扩展和新药研究的深入,GC-MS已由单纯的提供数据,上升到从数据、图谱中获得有用的信息和因素,以解决新药研究中的实际问题。GC-MS应用于中药指纹图谱的研究还有许多理论问题需要解决以及如何尽快提高学术研究向生产实践转化的能力,建立多维、多息特征谱能较系统、较好地解决中药制剂保证药效和质量的难题;并可解决中药研究中缺乏标准品的难题,采用多种色谱联用,不必取得纯品就可实现对混合物中化学成分的确认。随着电子计算机和仪器装置不断升级,GC-MS及多种色谱联用形成越来越广泛的应用范畴,未来的GC-MS仍将显示其蓬勃的生命力。
参考文献
[1]王少军,段启,曹君,张继华,龚千锋.豆蔻壳挥发油成分的GC-MS分析[J].中成药,2005,(07) .
[2]朱缨.蛇床子挥发油成分的气相色谱-质谱联用分析[J].时珍国医国药 , 2006,(10).
关键词:GC-MS;中药;质量控制
中图分类号:TQ
文献标识码:A
文章编号:1672-3198(2010)09-0362-03
气相色谱法(Gas chromatography,GC)是近年来应用日趋广泛的分析技术,特别适用于具有挥发性的复杂组分的分离、分析,由于是以气体作为流动相,所以传质速度快,一般的样品分析可在20-30s左右完成,具有分离效能高,灵敏度高的特点,在有对照品的条件下,可作定性、定量分析,但对重大事件或有争议的样品不能做出肯定鉴定报告,必须连接如质谱的检测器。另外对于不能气化的样品则需要作衍生化处理后再分析。质谱(Mass Spectrnum,MS)是强有力的结构解析工具,能为结构定性提供较多的信息,是理想的色谱检测器。气相色谱-质谱(GC-MS)联用利用了色谱的高分离能力和质谱的高鉴别特性,可对复杂的混合样品进行分离、定性、定量分析的一次完成,是一种完美的现代分析方法。GC-MS的常用测定方法:总离子流色谱法(total ionization chromatography,TIC)—— 类似于GC 图谱,用于定量。反复扫描法(repetitive scanning method,RSM)——按一定间隔时间反复扫描,自动测量、运算,制得各个组分的质谱图,可进行定性。质量色谱法(mass chromatography,MC)——记录具有某质荷比的离子强度随时间变化图谱。在选定的质量范围内,任何一个质量数都有与总离子流色谱图相似的质量色谱图。GC-MS技术随着仪器的不断完善与发展,检测技术的成熟与推广,其应用范围越来越广。由于GC-MS技术检测灵敏度高,分离效能好,使之在中药研究领域的应用越来越受到重视。在挥发油、生物碱、糖类、脂肪酸类、甾类化合物分析方面均有广泛应用。在质量控制方面GC-MS也得到了越来越广泛的应用。
1 化学成分研究
中药是经过炮制的各类饮片和按照四气五味、君臣佐使等特性与法则配比而成的方剂药物,其化学成分复杂且含量差异大,一种仪器的使用往往很难得到准确结果,GC-MS利用了色谱的高分离能力和质谱的高鉴别特性可以快速得到准确结果。
1.1 挥发油分析
GC-MS以其高分辨率、高灵敏度和简便准确的特点,成为挥发油分析中最常使用的分析方法。
1.1.1 中药材及中药未知成分的鉴定
王少军等用水蒸气蒸馏法从豆蔻中提取挥发油,用归一化法测定各组分的相对百分含量,并用气相色谱-质谱法对其化学成分进行鉴定,共鉴定了71个成分,占挥发油总成分的89%以上。气相色谱分析条件:色谱柱为ULTKA22 (50 m ×0. 20 mm ×0. 25μm)弹性石英毛细管柱;进样口温度220°C;接口温度250°C;载气为氦气,流速0. 9 mL•min-1;分流比60∶1;进样量0.8μL;升温程序:柱温60 °C,保持1 min,以10°C/min升至100 °C,保持2min,再4°C/min升至200°C,保持3min,再20°C/min升至320 °C。质谱条件:电离方式EI,电子轰击能量70 ev,离子源温度230°C,加速电压34.6V,分辨率2500,扫描范围30～350aum,倍增器电压1341 v,N IST298标准质谱图库。
朱缨用气相色谱-质谱法对江苏产蛇床子挥发油化学成分进行分析,用水蒸气蒸馏法从蛇床子挥发油中提取挥发油,研究其分离分析的条件,对分离的物质用GC-MS鉴定,归一法确定其相对百分含量,鉴定了27个主要成分。
童星用气相色谱-质谱联用技术测定了最佳提取条件下所得常春藤挥发油的化学成分及其相对质量分数,共分离出30种成分并鉴定出其中21种,主要是萜烯类化合物以及环氧衍生物(33.17%),邻苯二甲酸异丁基酯(18.89%),氧化石竹烯(15.10%),花生酸(13.65%),香紫苏内酯(6.17%),匙叶桉油烯醇(4.77%),葎草烯(2.49%),α-石竹萜烯(1.41%)。说明GC-MS稳定可靠,重现性好,适用于中药挥发油的化学成分分析。
1.1.2 中药有效成分分析测定
钦旦新等使用GC-MS法,对缅甸产樟属两种植物cinnamomun multiflorum,C.bejolghota(钝叶桂)茎皮与中药肉桂(C.cassis)这3种植物的乙醚提取物进行定性、定量分析,根据IR及MS图谱对所含化合物进行鉴别,根据峰面积计算化合物的相对含量,结果表明在鉴定的62个化合物中,C.multiflorum的主要成分为单萜及其衍生物(53.18%),其中桂皮醛的含量(29.57%)甚至高于肉桂(22.36%),C.bejolghota的主要成分为倍半萜及其衍生物(58.18%),其中丁香酚含量为三者最高。明确了C.multiflorum与C.bejolghota的挥发性、半挥发性成分的化学组成,提示C.multiflorum、C.bejolghota可作为肉桂的代用品。对中药有效成分测定可为寻找稀缺药材代用品提供线索。
对中药有效成分测定可为探索中药配伍提供线索。如魏凤环等建立气相色谱 -质谱法 (GC- MS)测定麻黄汤中桂皮醛含量的方法,研究配伍对桂皮醛含量的影响。采用GC- MS法测定桂皮醛的含量,并用 MS鉴定其他色谱峰,用 L8(2 7)正交设计安排试验,统计软件(SPSS10.0 )分析麻黄、杏仁、甘草及两两交互作用对桂皮醛含量的影响,p H计测定各组合的 p H值。结果表明麻黄、杏仁显著降低桂皮醛的含量 ,甘草及交互作用则对其含量的降低无统计学意义。色谱/质谱条件: 色谱柱: HP-5 弹性石英毛细管(30 mm ×0.5 mm ×0.25 mm ), 进样量: 1μL ,无分流进样, 进样口温度: 220℃, 载气: He, 载气为恒流模式,柱流量: 110mL/m in。柱初温: 120℃,以8℃/m in 升至250℃,接口温度: 280℃,离子源:EI,电离能量: 70eV ,倍增电压: 1675 V。
李吉来等建立麻黄汤煎液中麻黄碱与伪麻黄碱的GC-MS定量方法,测定麻黄汤及麻黄与其它各味中药配伍后构成的组方中麻黄碱与伪麻黄碱的煎出量,并考查其煎出量的变化,GC-MS选用特征离子定量法进行测定。结果麻黄单煎液中麻黄碱与伪麻黄碱的溶出量较与杏仁合煎液中显著减少,较与桂枝合煎液中显著增多,较与甘草合煎液中无明显变化。说明该法准确、可靠,可作为麻黄汤中麻黄碱与伪麻黄碱的定量方法 。
1.1.3 药效及药动研究
贺丰等用GC-MS法测定麻黄碱(ephedrine,E)、伪麻黄碱(pseudoephedrine,PE)人血藥浓度,所得数据用WinNonlin4.0.1药代动力学程序处理,求出有关参数,E、PE分别在5～1000ng/mL,2.5～500ng/mL的范围内线性关系良好(r2=0.9985,r2=0.9994),加样回收率分别为107.5%～96.2%,102.5%～93.9%,两者日内、日间精密度的RSD<5%,血浆样品60d内稳定,符合生物样本分析要求,表明GC-MS稳定、准确,灵敏度高,适于E、PE的血药浓度测定。
曹兴华建立气相色谱-质谱(GC-MS)法测定异丙酚血浆药物浓度的方法学,为研究异丙酚的药代-药效动力学提供科学的分析技术。气相色谱(GC)的色谱柱为HP-5石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm),载气为高纯氦(99.999%),柱流量为1ml•min～(-1),进样口压力为7.99p.s.i,进样口温度为240℃,进样方式为手动无分流进样,进样量为1.0μl。程序升温,起始55℃维持1min,以20℃/min速度升至150℃,维持3min,共运行8.75min。质谱(MS)为电离方式EI,电子能量70ev,接口温度280℃,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,选择离子采集(SIM)。用于异丙酚和麝香草酚定性的检测离子分别为:异丙酚碎片离子m/z为163、分子离子m/z为178;麝香草酚碎片离子m/z为135、分子离子m/Z为150;异丙酚与内标物峰面积的比值作为定量参数。
1.2 生物碱分析
生物碱是源自动植物机体内的具有强烈生理效能的碱性物质,其结构比较复杂,分子极性相差较大,常用GC-MS分析,具有不需标准品的优点。
朱全红等建立 GC-MS 测定麻黄汤代谢产物麻黄类生物碱浓度的方法。方法:尿样经5 mol•L～(-1)氢氧化钾碱化后,用乙酸乙酯萃取。以二苯胺为内标,采用 GC-MS 分离并同时测定了人体口服麻黄汤后尿中5种麻黄碱的浓度,检测方式为选择离子(m/z 44,m/z 58,m/z 72,m/z 169),色谱条件:色谱柱为 DB-5MS 毛细管柱(30 m×250μm,0.25μm),载气为 He(1 mL•min～(-1)),无分流进样,进样量1μL。起始温度70℃(1 min)125℃(5min)270℃(5 min)。用该方法测定6名健康志愿者单次口服麻黄汤后尿液中麻黄碱类代谢产物的浓度,在24 min 内去甲伪麻黄碱(NMP)、去甲麻黄碱(NME)、麻黄碱(E)、伪麻黄碱(PE)和甲基麻黄碱(ME)达到良好分离,五种麻黄类生物碱的回收率均在88.74%-102.70%之间,日内和日间精密度均10%。表明GC-MS简单、灵敏、准确,重复性好,可用于麻黄中药复方代谢产物麻黄类生物碱的测定。
赵宝玉等采用GC-MS联用技术从牛心朴子的全草中分离鉴定出12种生物碱,分别为2,4,6-三甲基吡啶;2,6-二乙基吡啶;4-(1-哌啶)-2-丁酮;苯并噻唑;3-正丙基-2,6-二苯基吡啶;娃儿藤定碱;2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮;Diazen,butyl[1-(2,2-dimethylhydr)];5,10-Diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a;1`,2`-d]pyrazine;9-Azabicyclo[3,3,1]nonane,9-methyl-;Piperidino[2,3-b]2,3-dihtdroindene,1-methyl-4,4a-diethyl-6-methyl-;7,14-Methano-4H,6H-dipyrido[1,2-a:1`,2`-E][1,5]diazocin-4-one,7,7a,8,9,10,11,13,14-oc-tahydro-,[7R-(7,alpha,7a,alpha,14,alpha)]。其中后6种为首次从该植物中分得。表明GC-MS可用于对牛心朴子的全草生物碱分离。
1.3 脂溶性成分分析
张小燕等采用气质联用技术对中药麦冬的三氯甲烷部位进行化学成分分析,通过质谱棒图分析及NIST98谱库检索,确定了气质联用分析条件,从麦冬块根的三氯甲烷部位测得32个脂溶性成分。表明GC-MS解析了麦冬低极性部位的化学成分,为全面反映麦冬的化学成分提供依据。
洪永福等采用气相色谱-质谱(GC-MS)从 3种木瓜的乙醚提取部位中首次分离与鉴定出61个化合物,其中皱皮木瓜 (Chaenomeles lagenaria)40个化合物,宣木瓜 (C.lagenaria产自安徽宣州) 34个化合物,光皮木瓜 (C.sinensis) 23个化合物。有10个化合物在 3種木瓜中都含有,但相对含量差别大。它们是乙酸、苯甲醛、正葵酸、14-甲基十五烷酸甲酯、丙三醇、苯甲酸、6,9-十八碳二烯酸甲酯、角鲨烷、硬脂酸和二十烷基油酸酯。表明GC-MS解析了3种木瓜低极性部位的化学成分,为全面反映木瓜的化学成分提供依据。
丁旭光等以石油醚为溶剂,采用索氏提取法提取中药木鳖子中脂肪酸,经甲酯化处理后,用GC-MS联用仪对中药木鳖子中脂肪酸组成进行了分析和鉴定共分离出14种脂肪酸,占脂肪酸总量的89.23%。
刘君等采用GC-MS法分析了中药蚂蟥脂肪酸的组成,鉴定了19个组分,其中不饱和脂肪酸占71.84%,饱和脂肪酸占20.71%。
文震等利用气相色谱-质谱 (GC-MS) 联用,对两种常见海洋中药粗吻海龙 ( Trachyrhaphus serratus ) 与多棘海星 ( Asterias amurensis ) 中的甾醇化合物进行了分析。经鉴定,海龙的甾醇成分主要为胆甾醇类,海星甾醇主要为△7-脱氢胆甾醇、麦角甾醇与豆甾醇类化合物。
1.4 糖类化合物分析
糖类化合物是多数中草药中的成分,糖分为单糖、寡糖和多糖。质谱由于选择性良好、灵敏度高、专一性强,传统的GC-MS一直是糖类衍生物痕量分析选择的方法。由于糖类本身没有足够的挥发性,必须将其转化为挥发性衍生物才能进行GC-MS分析;多糖要首先降解为单糖或简单的寡糖然后衍生。
郭方遒等采用红外、气质联用技术分析了枸杞水溶性多糖中单糖组成及其含量。结果表明,枸杞多糖里含有的单糖包括阿拉伯糖,鼠李糖,木糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,其含量比例为13.19∶3.41∶2.92∶10.53∶18.92∶9.82。
周斌等对烟草中的糖类用水超声提取,用C18SPE柱预分离,衍生化后用GC-MS分析测定。结果表明,方法的检出限范围是4.7～7.6 ng,加标回收率为96%～106%,相对标准偏差(RSD)为4.63%～6.06%。实验证明GC-MS分析烟草中的糖类具有较高的准确度、快速和简便的特点。
2 质量控制研究
2.1 中药指纹图谱研究
中药指纹图谱是一种综合的量化的色谱鉴别手段,以达到鉴别真伪、评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性为目的。中药指纹图谱技术能够有效鉴别样品的真伪或产地,能够有效控制中药及复方样品的质量,能确保中药产品及复方制剂质量的相对稳定。因此,在有效成分不完全明确的前提下,测定中药材或中成药的特征指纹图谱具有重大的意义。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段。
气相色谱质谱联用(GC-MS)技术作为中药指纹图谱研究的先进手段之一,日益走向技术应用的前台。一般而言,中药挥发油大多含有几十到一百个成分,且这些成分随药材品种、产地、采收时节、炮制方法等不同在很大程度上也会发生变化。挥发油虽然所含成分数量不少,但其实都有为数不多(几个到十几个)的特征性成分,以这些含量大、为数不太多的特征指标成分群开展挥发油指纹图谱的研究,切实可行、简便实用。
魏刚探讨GC-MS建立中药特征指纹图谱色谱条件的参数设置,在石菖蒲、广藿香等实例研究的基础上,对溶剂的种类和数量,以及升温程序、电离电压、柱前压与流速、离子源温度、进样口温度等仪器参数进行比较,结果升温程序、电离电压、柱前压与流速等对特征指纹图谱的影响较大,而离子源温度、进样口温度的影响较小,表明用GC-MS建立中药特征指纹图谱方法先进、可靠。
魏刚采用GC-MS制定了麝香芳香水中麝香酮的含量限度, 同时建立了石菖蒲挥发油的特征指纹图谱,麝香芳香水中麝香酮可控制在 0 .16 6～ 0 .2 0 2mg/mL之间,3批成品麝香酮含量差异RSD =4.49%,不超过10 % ,以甲基丁香酚、顺式甲基异丁香酚、反式甲基异丁香酚、榄香素、β-细辛醚、α-细辛醚 6个主要成分的出峰先后顺序及其相对含量为特征构成了石菖蒲挥发油的特征指纹图谱,以上特征在成品中可以重复。
欧阳臻等用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析不同产地17个茅苍术样品,研究茅苍术挥发油的指纹图谱,为茅苍术的内在质量评价和鉴定提供特征性数据。采用"中药指纹图谱相似性计算"软件进行模式分析及相似度计算并进行SPSS聚类分析;建立道地茅苍术的特征指纹图谱并研究有效成分之间的配比。建立了5批道地茅苍术的共有指纹图谱模式,挥发油中苍术酮、茅术醇、β-桉叶醇和苍术素4种有效成分呈一特定的配比关系,即(0.89～1.12)∶(0.11～0.15)∶(0.48～0.61)∶1;相似度计算结果表明不同产地茅苍术与道地的相比差异明显;聚类分析结果可分为2大类,道地产区可与江苏汤山的和江苏南山的聚为一类,安徽和湖北的聚为一类。茅苍术指纹图谱的建立和有效成分配比关系分析结合聚类分析的方法可用于茅苍术质量控制,为全面有效评价茅苍术质量提供可靠依据。
2.2 生产工艺研究
中药指纹图谱必将成为中药质量评价的发展趋势,规范、标准的中药指纹图谱的实施,将会有力地促进实现中药现代化的进程。原料药材质量的提高和稳定是制剂指纹图谱能否成功建立的首要问题;生产工艺的规范和优化是研究实施指纹图谱的另一个重要环节。GC-MS在生产工艺研究上的应用加快了质量控制的规范化进程并且作为指纹图谱的一个环节促进指纹图谱研究发展从而进一步规范质量控制。
曾经考等采用GC -MS对加味苍耳子散、清上祛痛胶囊、肠炎灵片、健中疡愈片等复方制剂挥发油进行分析,结果发现单味药挥发油的特征成分或主要成分基本能从复方挥发油中检出;而在一些成品中仅检出脂肪酸类挥发性成分,表明其制剂工艺未对挥发油进行收集或挥发油损失过多,有待改进。研究结果表明GC-MS可广泛应用于中药复方制剂挥发油的工艺研究与质量控制 。
魏刚等采用GC-MS对加味苍耳子散组方中每味药材所含挥发油的主要成分进行追踪,确定加味苍耳子散挥发油提取工艺为:辛夷、丹皮粉碎成粗粉,合并薄荷采用水蒸气蒸餾法提油,收集 13倍的初蒸馏液,再收集3倍量的重蒸馏液;川芎挥发油采用醇提;苍耳子、白芷含挥发油很少,同时为避免苍耳子水提产生毒性及白芷香豆素类成分遭破坏,其油不予提取。表明GC-MS是追踪优化中药复方挥发油提取工艺的强有力工具,值得推广。
3 结语
GC-MS结合GC的高柱效、高分离性能与MS的定性功能,对挥发性未知成分与微量成分的结构确定有独到之处。在化学成分分析方面不仅广泛应用于挥发油分析还由于其不需要标准品的优点与HPLC、TLC等共同用于生物碱分析,还可用于糖类和脂肪酸类的衍生化后分析。
在中药现代化越来越成为中药发展的关键步骤的今天,对中药质量控制的规范化提出了越来越高的要求。GC-MS在指纹图谱研究和生产工艺控制方面起着不可或缺的作用。采用GC-MS制定了有效成分含量限度,以主要成分的出峰先后顺序及其相对含量为特征构成了中药的特征指纹图谱,以上特征在成品中可以重复。GC-MS是优化生产工艺、建立中药质量控制标准、提高中药复方的质量水平的有效手段之一。
由于中药成分的复杂性使得GC-MS的应用具有一定的局限性,往往难以提供精确的结构信息,随着应用范围的扩展和新药研究的深入,GC-MS已由单纯的提供数据,上升到从数据、图谱中获得有用的信息和因素,以解决新药研究中的实际问题。GC-MS应用于中药指纹图谱的研究还有许多理论问题需要解决以及如何尽快提高学术研究向生产实践转化的能力,建立多维、多息特征谱能较系统、较好地解决中药制剂保证药效和质量的难题;并可解决中药研究中缺乏标准品的难题,采用多种色谱联用,不必取得纯品就可实现对混合物中化学成分的确认。随着电子计算机和仪器装置不断升级,GC-MS及多种色谱联用形成越来越广泛的应用范畴,未来的GC-MS仍将显示其蓬勃的生命力。
参考文献
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[2]朱缨.蛇床子挥发油成分的气相色谱-质谱联用分析[J].时珍国医国药 , 2006,(10).