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摘要：【目的】克隆玉米肌動蛋白解聚因子4（ZmADF4）基因，并对其转录活性和表达模式进行分析，为探究玉米ADF家族基因的功能及调控机制提供参考依据，也为玉米抵抗逆境胁迫研究提供潜在的基因资源。【方法】采用同源克隆技术克隆玉米叶片ZmADF4基因，运用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、保守结构域及二、三级结构;通过原生质体瞬时转化进行亚细胞定位;利用酵母自激活分析该基因转录活性，下载RNA-Seq数据分析其在不同组织中的表达特性，并利用实时荧光定量PCR检测其在不同逆境胁迫下的表达情况。【结果】从玉米叶片克隆获得的ZmADF4基因，编码区（CDS）长度为420 bp，编码139个氨基酸残基，蛋白分子量为15.855 kD，理论等电点（pI）为7.66，属于亲水性蛋白，具有典型的植物ADF蛋白家族的保守结构域ADF_gelsolin，主要定位于细胞质中。ZmADF4基因不具有转录自激活效应，且在根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮等组织中呈差异性表达，在茎、果皮和叶片中表达量较高。ZmADF4基因对高温胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、干旱胁迫及脱落酸处理均有响应，其中高温胁迫下，整体呈上调表达趋势，而低温胁迫和脱落酸处理下，整体呈下调表达趋势，干旱和高盐胁迫下则呈先上调再下调表达的趋势。【结论】ZmADF4基因属于ADF基因家族成员，不仅参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控，还参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。
关键词： ZmADF4;基因克隆;亚细胞定位;表达分析;非生物胁迫
中图分类号： S513.035.3 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0879-09
Cloning， transcription activity and expression analysis of actin-depolymerizing factor 4，ZmADF4 in maize（Zea mays L.）
WANG Xin1，2， HUANG Jun1， LI Gao-ke2*
（1College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China; 2Crop Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop
Genetic Improvement， Guangzhou 510640， China）
Abstract：【Objective】To provide reference for studying the function and regulation pattern of maize ADF family gene and provide potential gene resources for stress resistance in maize，the actin-depolymerizing factor 4（ZmADF4） gene was cloned and its transcription activity and expression pattern were analyzed. 【Method】The ZmADF4 gene was cloned from maize leaves by homologous cloning technology. The physicochemical properties，conserved domains， secondary and tertiary structures of the encoded protein were predicted by bioinformatics analysis. Subcellular localization was carried out by transient transformation of protoplasts，and its transcriptional activity was analyzed by yeast self activation. The expressions of ZmADF4 gene in different tissues were analyzed by RNA-Seq data downloaded and its expressions under different stress treatments were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The results showed that the ZmADF4 gene was successfully cloned from maize leaf. The full length coding region（CDS）of ZmADF4 was 420 bp，which encoded a 139 amino acids residues. The molecular weight of the protein was 15.855 kD and its theoretical isoelectric point（pI） was 7.66. The protein encoded by ZmADF4 gene belonged to hydrophilic protein，which had conserved domain ADF_gelsolin of typical ADF protein family and mainly located in cytoplasm. ZmADF4 gene had no self activating activity by transcriptional activity analysis. Further studies showed that the gene was differentially expressed in maize roots，stems，leaves，silks，anthers，embryo，endosperm and pericarps，with expressed highly in stems，pericarps and leaves. Moreover， the expressions of ZmADF4 gene changed under high temperature，low temperature，high salt stress， drought stress and abscisic acid（ABA）stress. The expression of ZmADF4 gene was up-regulated under high temperature，while down-regulated under low temperature and ABA stress. Under drought and high salt stress， the expression was first up-regulated and then down-regulated. 【Conclusion】ZmADF4 gene，belonging to ADF gene family， not only participates in the growth and development regulation of maize stalks， peel and leaves， but also in the adverse response regulation of low temperature， high temperature， drought and ABA and salt stresses. Key words： ZmADF4; gene cloning; subcellular localization; expression analysis; abiotic stress
Foundation item： Key Area Research and Development Project of Guangdong（2018B020202008）;Construction Project of Discipline Team of Agricultural Advantage Industry for 14th Five-year Plan of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202115TD）; Guangdong Provincial Rural Revitalization Strategy Special Project（Yuecainong〔2020〕-100）
0 引言
【研究意义】肌动蛋白解聚因子（Actin-depolymerizing factors，ADFs）是一种分子量较小的肌动蛋白（Actin）结合蛋白，是细胞骨架重组的重要分子之一。肌动蛋白普遍存在于真核生物细胞，是细胞微丝骨架的重要组分。微丝骨架在细胞形态控制、运动、防御、信号传导和重力感应等方面发挥关键作用（Hardham et al.，2007;Rottner and Stradal.，2010;魏芳和马鸿翔，2011;Huang et al.，2013;Roy-Zokan et al.，2015;Nan et al.，2017）。ADFs蛋白家族庞大，且分子量较低，约15～22 kD（Staiger et al.，1997;Huang et al.，2020），常与丝状肌动蛋白（F-actin）和单体肌动蛋白（G-actin）结合，提高其解聚活性（Nan et al.，2017）。玉米（Zea mays L.）作为重要的粮食、饲料以及能源作物，其生长常受到干旱、盐碱和低温等逆境胁迫的阻碍（曹士亮，2013），亟需探究逆境胁迫下对玉米生长起调控作用的遗传因素。已有研究发现，大多数植物ADFs家族基因具有高度的保守性，且在逆境胁迫中发挥重要作用（李红春等，2020）。因此，克隆玉米ADF基因并进行表达分析对深入探究玉米ADF家族基因的功能及提高抗逆境胁迫能力具有重要意义。【前人研究进展】目前已对多种植物ADF基因家族成员进行全基因组鉴定，结果发现水稻ADF基因家族成员数量为12个（Feng et al.，2006），拟南芥12个（Ruzicka et al.，2010），香蕉27个（Roy-Zokan et al.，2015），杨树14个（Khatun et al.，2016），番茄11个（Nan et al.，2017）。通过系统发育进化分析发现，高等植物ADF蛋白可分为四大类群（I～IV），其中II类群分可分为2个亚类（II-a和II-b）（Feng et al.，2006）。拟南芥ADF家族基因中，AtADF1、AtADF2、AtADF3和AtADF4基因属于I亚类，在不同组织（除花粉外）中均具有較高的表达水平，而属于II-a亚类的AtADF7和AtADF10基因则相反，在花粉中特异性表达（Feng et al.，2006），属于II-b亚类的AtADF8和AtADF11基因则在根表皮细胞中特异性表达;AtADF5、AtADF9和AtADF6基因分别属于III和IV类群，其中AtADF9基因在根下根尖区、毛状体、茎尖分生组织和愈伤组织中表达更高（Burgos-Rivera et al.，2008），而AtADF5基因的表达仅限于根尖分生组织。但对于植物ADF家族基因的功能研究报道较少，如拟南芥AtADF1和AtADF4基因调控植株形态改变（Dong et al.，2001;彭世清和黄冬芬，2006），其中，AtADF4基因编码蛋白通过修饰肌动蛋白细胞骨架介导防御信号，是植物防御信号通路中的新组分（Tian et al.，2009）;AtADF7基因调控植物花粉的形成和花粉管的伸长，对种子形成和发育发挥作用（Zheng et al.，2013）;AtADF9基因在茎尖分生组织中通过参与胞质和核进程调控细胞发育，从而影响植物的生长（Burgos-Rivera et al.，2008）;水稻OsADF3基因主要参与植株对逆境胁迫的响应，以提高抗逆性（Huang et al.，2012）;玉米ZmADF3基因在根毛细胞中通过控制肌动蛋白的翻转而不是直接与其结合，以促进根毛的生长（Chang et al.，1997），ZmADF1基因在玉米花粉和花粉管形成发育中发挥调控作用（Hussey et al.，2010），说明植物ADF家族基因参与促进细胞活动。【本研究切入点】当前对植物中ADF家族基因的功能研究，主要集中于对植物生长发育、形态结构的影响及细胞防御等方面。关于玉米ADF家族基因的研究相对较少，鲜见有关ZmADF4基因克隆及转录活性和表达分析的研究报道。【拟解决的关键问题】从玉米自交系B73中克隆ZmADF4基因，对其进行亚细胞定位，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同逆境胁迫下该基因的表达模式，为深入探究玉米ADF家族基因的功能及调控机制提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为玉米自交系B73，由华南农业大学农学院甜玉米遗传育种实验室保存。转基因所需的菌株为大肠杆菌感受态Trans5α、酵母感受态Y2HGold，购自北京擎科生物科技有限公司广州分公司。荧光蛋白表达载体pRTVnVn、酵母自激活载体pGADT7和pGBKT7由华南农业大学农学院甜玉米遗传育种实验室提供。总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Plus Kit）、反转录试剂盒[FastKing RT Kit（With gDNase）]、实时荧光定量试剂盒[2×TSING Master qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）]购自天根生化科技（北京）有限公司。凝胶回收试剂盒（SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit）和质粒小提试剂盒（SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。限制性内切酶BamH I、Hind III、Nde I和EcoR I购自美国NEB公司。质粒大提试剂盒（FinePure EndoFree Plasmid Maxi Kit）购自北京济凡生物科技有限公司。Trelief TM SoSoo Cloning Kit、Macerozyme R-10和Cellulase R-10购自北京擎科生物科技有限公司广州分公司。卡那霉素（Kanamycin，Kan）和Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。引物合成和PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。主要仪器设备：电泳仪（Bio-Rad，美国）、凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）、离心机（SIGMA，德国）、超微量紫外分光光度计（Biotek，美国）、激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）、PCR仪（Bio-Rad，美国）和荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）。 1. 2 试验方法
1. 2. 1 总RNA提取及cDNA合成 称取0.1 g左右新鲜玉米叶片，加入液氮充分研磨，参照总RNA提取试剂盒说明提取叶片中的总RNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测提取质量和吸光值（OD260和OD280）。质量检测合格后，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链，于-20 ℃保存备用。
1. 2. 2 ZmADF4基因克隆及其载体构建 根据玉米标准基因组数据库（http：//www.maizegdb.org）中的ADF4基因序列（ZEAMMB73_452408），利用Pri-mer 3.0设计其特异性扩增引物p-ADF4-F/p-ADF4-R和BD-ADF4-F/BD-ADF4-R，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。以玉米B73叶片cDNA为模板进行PCR扩增，参照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase说明配制反应体系50.0 μL：2×Phanta Max Buffer 25.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，DNA聚合酶1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 15 s，67 ℃ 15 s，72 ℃ 24 s，进行34个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的片段。
用限制性内切酶BamH I和Hind III对荧光蛋白质粒pRTVnVn进行双酶切，用Nde I和EcoR I对酵母自激活载体pGBKT7进行双酶切，同样对PCR扩增获得的目的片段进行双酶切。分别回收上述酶切产物，通过体外连接的方法把目的片段分别与pRTVnVn和pGBKT7酶切片段连接起来，从而构建pRTVnVn-ZmADF4融合表达载体和pGBKT7-ZmADF4自激活载体，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取阳性单克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的单克隆菌液保存并提取质粒备用。
1. 2. 3 生物信息学分析 通过ExPASy预测ZmADF4蛋白的理化性质;采用NCBI数据库CDD进行保守结构域预测分析。运用SOPMA和SWISS-MODEL预测ZmADF4蛋白的二、三级结构。
1. 2. 4 亚细胞定位 取黑暗培养至2叶1心期的玉米黄化苗新鲜叶片，提取原生质体，利用原生质体瞬时转化的方法，将质粒pRTVnVn-ZmADF4转化玉米原生质体细胞，置于激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位情况。
1. 2. 5 转录活性分析 将已构建好的载体质粒pGBKT7-ZmADF4+pGADT7、pGBKT7-53（阳性对照）和pGBKT7（阴性对照）质粒分别转化Y2H酵母菌株，并接种于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu/X-α-gal和SD/-Trp-Leu/X-α-gal/AbA培养基上，28 ℃培养2 d，观察酵母菌落生长情况。
1. 2. 6 基因组织特异性表达分析 从玉米标准基因组数据库下载RNA-Seq数据，分析ZmADF4基因在玉米根（播种后7 d，7DAS）、茎（3叶期）、叶（3叶期）、花丝（吐丝期，R1）、花药（吐丝期，R1）、胚（授粉后20 d，20DAP）、胚乳（授粉后20 d，20DAP）和果皮（授粉后20 d，20DAP）的表达特性。
1. 2. 7 逆境胁迫下基因表达模式分析 将玉米种子播于温室盆栽沙土中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗周期下培养。对2周龄生长状态相同的幼苗进行高温胁迫（40 ℃）、低温胁迫（4 ℃）、盐胁迫（0.2 mol/L NaCl）、干旱胁迫（20% PEG-6000）及脱落酸（0.1 mmol/L）处理，以不作处理的幼苗为对照（CK）。分别在处理0、0.5、1.0、2.0、4.0和12.0 h时对3株幼苗进行取样，提取总RNA，反转录合成cDNA。使用2×TSING Master qPCR Mix预混液在荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR。用ZmActin基因作为内参。ZmADF4和ZmActin基因的qRT-PCR引物序列见表1。试验设3个生物學重复，每个反应体系配置3次技术重复。
1. 3 统计分析
采用2-??Ct方法计算相对基因表达量（Livak and Schmittgen，2001），用SPSS 22.0进行显著性分析，并用GraphPad Prism 8.0绘图。
2 结果与分析
2. 1 ZmADF4基因克隆及序列分析结果
以玉米叶片cDNA为模板扩增获得大小约450 bp的特异性条带，其测序结果显示，该条带序列与玉米遗传学和基因组学数据库（MaizeGDB）下载的基因序列（LOC100192897）一致，编码区（CDS）长度为420 bp（图1），编码139个氨基酸残基。
2. 2 ZmADF4蛋白理化性质及结构预测分析结果
ExPASy预测结果显示，ZmADF4蛋白的原子总数为2224个，化学分子式C701H1111N195O210S7，分子量15.855 kD，理论等电点（pI）7.66，蛋白脂肪系数78.63。ZmADF4蛋白亲水性均值（GRAVY）-0.369，不稳定系数44.15，故推测其为不稳定的亲水性蛋白。利用NCBI数据库中的CDD预测ZmADF4蛋白保守结构域，结果（图2）显示其含保守结构域ADF_gelsolin，属于ADF家族成员。ZmADF4蛋白二级结构预测结果（图3）显示，α-螺旋46个，占33.09%，延伸链37个，占26.62%，β-转角9个，占6.47%，无规则卷曲47个，占33.81%。利用SWISS-MODEL预测ZmADF4蛋白三级结构，结果（图4）发现，三级结构与二级结构预测结果相符。 2. 3 ZmADF4蛋白亚细胞定位结果
利用原生质体瞬时转化法将pRTVnVn（阴性对照）和pRTVnVn-ZmADF4融合表达载体转化玉米原生质体细胞中，在激光共聚焦显微镜下观察细胞定位情况，结果发现pRTVnVn在整个细胞内有很强的绿色荧光信号，而pRTVnVn-ZmADF4融合表达载体在玉米原生质体细胞质内有绿色荧光信号，但细胞膜中未发现（图5），推测ZmADF4蛋白定位于细胞质中。
2. 4 ZmADF4基因转录活性分析结果
将pGBKT7-ZmADF4+pGADT7、pGBKT7-53（阳性对照）和pGBKT7（阴性对照）质粒分别转化Y2H酵母菌株，并接种于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu/X-α-gal和SD/-Trp-Leu/X-α-gal/AbA，培养2 d后观察生长情况，结果（图6）发现，Y2H酵母菌株在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，在SD/-Trp-Leu/X-α-gal培养基上不显示蓝色，在SD/-Trp-Leu/X-α-gal/AbA培养基上未生长，与阴性对照酵母生长状况一致，表明pGBKT7-ZmADF4未发生自激活作用，即ZmADF4基因不具有转录自激活效应。
2. 5 ZmADF4基因在不同发育期组织中表达特性分析结果
为了探索ZmADF4基因在玉米生长发育过程中调控功能，对ZmADF4基因在玉米根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮中的表达情况进行分析，结果（图7）表明ZmADF4基因在不同发育阶段的组织中呈差异性表达，其表达量大小排序为：茎>果皮>叶>根>胚>胚乳>花药>花丝，说明ZmADF4基因功能可能涉及多个方面，但主要参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控。
2. 6 逆境胁迫下ZmADF4基因表达模式分析结果
ZmADF4基因在5个逆境胁迫下不同处理时间的表达模式如图8所示。低温胁迫下，ZmADF4基因在处理1.0和2.0 h时表达量较高，显著高于其他处理时间（P<0.05，下同），但与对照无显著差异（P>0.05，下同）（图8-A）。高温胁迫下，ZmADF4基因随着处理时间的增加呈波动变化，但整体上呈上调表达趋势，在4.0 h时达最大值（图8-B）。干旱胁迫下，处理0.5和1.0 h时ZmADF4基因表达量较对照显著升高，处理1.0 h达最大值，之后显著降低（图8-C）。脱落酸处理下，ZmADF4基因在不同处理时间的表达量显著低于CK，整体上呈下调表达趋势（图8-D）。高盐胁迫下，处理0.5～12.0 h ZmADF4基因表达量呈逐渐降低趋势（图8-E）。可见，ZmADF4基因对高温胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、干旱胁迫和脱落酸处理均有响应，推测玉米ZmADF4基因参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。
3 讨论
肌动蛋白作为一种古老的蛋白，广泛存在于真核生物细胞中，对细胞运动、发育与分化、物质转运、胁迫响应和细胞表面结构维持等均发挥重要作用。在大多数的非植物基因组中只存在1个或2个ADF/cofilin基因，而在植物中则存在庞大的ADF基因家族，导致植物和非植物生物生理功能差异。当细胞在受生物或非生物因素刺激或其发生了形态变化时，细胞中的肌动蛋白骨架会重新排列，ADF/cofilin作為主要的调控因子，在肌动蛋白动力学中发挥重要角色。但目前针对于玉米中ADF家族基因的研究报道较少，因此本研究选择玉米ADF家族成员ZmADF4基因作为研究对象，经蛋白理化性质及结构预测分析发现，ZmADF4基因的CDS序列长度为420 bp，编码139个氨基酸残基，该蛋白含有ADF蛋白家族的保守结构域ADF_gelsolin，定位于细胞质中，与水稻OsADF3基因定位结果一致（Huang et al.，2012），推测二者在功能上可能具有一定的相似性。虽然ADF家族基因在核苷酸序列上高度保守（魏芳和马鸿翔，2011;李红春等，2020），但在不同组织中的表达水平存在明显差异，如Khatun等（2016）研究发现番茄ADF家族基因在花、萼片、花瓣、雄蕊和子房等不同组织的表达水平存在显著差异。本研究也发现，ZmADF4基因在玉米根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮中均能稳定表达，推测此基因参与玉米不同组织的生长和代谢过程，但在不同组织中的表达水平存在明显差异，以茎、果皮和叶片中的表达水平较高，推测ZmADF4基因功能涉及多个方面，但主要参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控。
植物具有抵御逆境胁迫能力，对其生长发育和生产活动具有重大意义。据报道，拟南芥AtADF2、AtADF4和AtADF5基因及水稻OsADF3基因均能提高植物抵抗生物或非生物胁迫的能力（Clement et al.，2009;Tian et al.，2009;叶佳，2010;Huang et al.，2012）。玉米在生长过程中会遇到很多不利于生长的逆境因子，如贫瘠的土壤、高盐、高温、干旱等，均严重影响玉米的生长发育及产量（贾利强等，2020;姚启伦等，2021）。王楠（2016）研究发现，ZmADF5基因与玉米耐旱性相关，将其转入拟南芥后，植株生长加快，生育期缩短，以抵御干旱逆境。本研究对不同逆境胁迫下ZmADF4基因的表达模式进行检测，结果发现，该基因在干旱和高温胁迫诱导下表达上调，与番茄SlADF2、SlADF11和SlADF8基因在干旱和高温胁迫下的表达模式相似（Khatun et al.，2016），推测ZmADF4基因参与调控玉米在逆境胁迫下的生长发育。此外，本研究通过酵母自激活活性检测发现，ZmADF4基因不具备自激活活性，后续可通过酵母文库筛选和酵母双杂交实验验证与ADF4互作的蛋白，或可通过在拟南芥和玉米中过表达或敲除ZmADF4基因，从而进一步探讨ZmADF4基因的抗逆分子调控机制。 4 結论
ZmADF4基因属于ADF基因家族成员，不仅参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控，还参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： ZmADF4;基因克隆;亚细胞定位;表达分析;非生物胁迫
中图分类号： S513.035.3 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）04-0879-09
Cloning， transcription activity and expression analysis of actin-depolymerizing factor 4，ZmADF4 in maize（Zea mays L.）
WANG Xin1，2， HUANG Jun1， LI Gao-ke2*
（1College of Agriculture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China; 2Crop Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop
Genetic Improvement， Guangzhou 510640， China）
Abstract：【Objective】To provide reference for studying the function and regulation pattern of maize ADF family gene and provide potential gene resources for stress resistance in maize，the actin-depolymerizing factor 4（ZmADF4） gene was cloned and its transcription activity and expression pattern were analyzed. 【Method】The ZmADF4 gene was cloned from maize leaves by homologous cloning technology. The physicochemical properties，conserved domains， secondary and tertiary structures of the encoded protein were predicted by bioinformatics analysis. Subcellular localization was carried out by transient transformation of protoplasts，and its transcriptional activity was analyzed by yeast self activation. The expressions of ZmADF4 gene in different tissues were analyzed by RNA-Seq data downloaded and its expressions under different stress treatments were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The results showed that the ZmADF4 gene was successfully cloned from maize leaf. The full length coding region（CDS）of ZmADF4 was 420 bp，which encoded a 139 amino acids residues. The molecular weight of the protein was 15.855 kD and its theoretical isoelectric point（pI） was 7.66. The protein encoded by ZmADF4 gene belonged to hydrophilic protein，which had conserved domain ADF_gelsolin of typical ADF protein family and mainly located in cytoplasm. ZmADF4 gene had no self activating activity by transcriptional activity analysis. Further studies showed that the gene was differentially expressed in maize roots，stems，leaves，silks，anthers，embryo，endosperm and pericarps，with expressed highly in stems，pericarps and leaves. Moreover， the expressions of ZmADF4 gene changed under high temperature，low temperature，high salt stress， drought stress and abscisic acid（ABA）stress. The expression of ZmADF4 gene was up-regulated under high temperature，while down-regulated under low temperature and ABA stress. Under drought and high salt stress， the expression was first up-regulated and then down-regulated. 【Conclusion】ZmADF4 gene，belonging to ADF gene family， not only participates in the growth and development regulation of maize stalks， peel and leaves， but also in the adverse response regulation of low temperature， high temperature， drought and ABA and salt stresses. Key words： ZmADF4; gene cloning; subcellular localization; expression analysis; abiotic stress
Foundation item： Key Area Research and Development Project of Guangdong（2018B020202008）;Construction Project of Discipline Team of Agricultural Advantage Industry for 14th Five-year Plan of Guangdong Academy of Agricultural Sciences（202115TD）; Guangdong Provincial Rural Revitalization Strategy Special Project（Yuecainong〔2020〕-100）
0 引言
【研究意义】肌动蛋白解聚因子（Actin-depolymerizing factors，ADFs）是一种分子量较小的肌动蛋白（Actin）结合蛋白，是细胞骨架重组的重要分子之一。肌动蛋白普遍存在于真核生物细胞，是细胞微丝骨架的重要组分。微丝骨架在细胞形态控制、运动、防御、信号传导和重力感应等方面发挥关键作用（Hardham et al.，2007;Rottner and Stradal.，2010;魏芳和马鸿翔，2011;Huang et al.，2013;Roy-Zokan et al.，2015;Nan et al.，2017）。ADFs蛋白家族庞大，且分子量较低，约15～22 kD（Staiger et al.，1997;Huang et al.，2020），常与丝状肌动蛋白（F-actin）和单体肌动蛋白（G-actin）结合，提高其解聚活性（Nan et al.，2017）。玉米（Zea mays L.）作为重要的粮食、饲料以及能源作物，其生长常受到干旱、盐碱和低温等逆境胁迫的阻碍（曹士亮，2013），亟需探究逆境胁迫下对玉米生长起调控作用的遗传因素。已有研究发现，大多数植物ADFs家族基因具有高度的保守性，且在逆境胁迫中发挥重要作用（李红春等，2020）。因此，克隆玉米ADF基因并进行表达分析对深入探究玉米ADF家族基因的功能及提高抗逆境胁迫能力具有重要意义。【前人研究进展】目前已对多种植物ADF基因家族成员进行全基因组鉴定，结果发现水稻ADF基因家族成员数量为12个（Feng et al.，2006），拟南芥12个（Ruzicka et al.，2010），香蕉27个（Roy-Zokan et al.，2015），杨树14个（Khatun et al.，2016），番茄11个（Nan et al.，2017）。通过系统发育进化分析发现，高等植物ADF蛋白可分为四大类群（I～IV），其中II类群分可分为2个亚类（II-a和II-b）（Feng et al.，2006）。拟南芥ADF家族基因中，AtADF1、AtADF2、AtADF3和AtADF4基因属于I亚类，在不同组织（除花粉外）中均具有較高的表达水平，而属于II-a亚类的AtADF7和AtADF10基因则相反，在花粉中特异性表达（Feng et al.，2006），属于II-b亚类的AtADF8和AtADF11基因则在根表皮细胞中特异性表达;AtADF5、AtADF9和AtADF6基因分别属于III和IV类群，其中AtADF9基因在根下根尖区、毛状体、茎尖分生组织和愈伤组织中表达更高（Burgos-Rivera et al.，2008），而AtADF5基因的表达仅限于根尖分生组织。但对于植物ADF家族基因的功能研究报道较少，如拟南芥AtADF1和AtADF4基因调控植株形态改变（Dong et al.，2001;彭世清和黄冬芬，2006），其中，AtADF4基因编码蛋白通过修饰肌动蛋白细胞骨架介导防御信号，是植物防御信号通路中的新组分（Tian et al.，2009）;AtADF7基因调控植物花粉的形成和花粉管的伸长，对种子形成和发育发挥作用（Zheng et al.，2013）;AtADF9基因在茎尖分生组织中通过参与胞质和核进程调控细胞发育，从而影响植物的生长（Burgos-Rivera et al.，2008）;水稻OsADF3基因主要参与植株对逆境胁迫的响应，以提高抗逆性（Huang et al.，2012）;玉米ZmADF3基因在根毛细胞中通过控制肌动蛋白的翻转而不是直接与其结合，以促进根毛的生长（Chang et al.，1997），ZmADF1基因在玉米花粉和花粉管形成发育中发挥调控作用（Hussey et al.，2010），说明植物ADF家族基因参与促进细胞活动。【本研究切入点】当前对植物中ADF家族基因的功能研究，主要集中于对植物生长发育、形态结构的影响及细胞防御等方面。关于玉米ADF家族基因的研究相对较少，鲜见有关ZmADF4基因克隆及转录活性和表达分析的研究报道。【拟解决的关键问题】从玉米自交系B73中克隆ZmADF4基因，对其进行亚细胞定位，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测不同逆境胁迫下该基因的表达模式，为深入探究玉米ADF家族基因的功能及调控机制提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为玉米自交系B73，由华南农业大学农学院甜玉米遗传育种实验室保存。转基因所需的菌株为大肠杆菌感受态Trans5α、酵母感受态Y2HGold，购自北京擎科生物科技有限公司广州分公司。荧光蛋白表达载体pRTVnVn、酵母自激活载体pGADT7和pGBKT7由华南农业大学农学院甜玉米遗传育种实验室提供。总RNA提取试剂盒（RNAprep Pure Plant Plus Kit）、反转录试剂盒[FastKing RT Kit（With gDNase）]、实时荧光定量试剂盒[2×TSING Master qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）]购自天根生化科技（北京）有限公司。凝胶回收试剂盒（SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit）和质粒小提试剂盒（SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。限制性内切酶BamH I、Hind III、Nde I和EcoR I购自美国NEB公司。质粒大提试剂盒（FinePure EndoFree Plasmid Maxi Kit）购自北京济凡生物科技有限公司。Trelief TM SoSoo Cloning Kit、Macerozyme R-10和Cellulase R-10购自北京擎科生物科技有限公司广州分公司。卡那霉素（Kanamycin，Kan）和Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。引物合成和PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。主要仪器设备：电泳仪（Bio-Rad，美国）、凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）、离心机（SIGMA，德国）、超微量紫外分光光度计（Biotek，美国）、激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）、PCR仪（Bio-Rad，美国）和荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）。 1. 2 试验方法
1. 2. 1 总RNA提取及cDNA合成 称取0.1 g左右新鲜玉米叶片，加入液氮充分研磨，参照总RNA提取试剂盒说明提取叶片中的总RNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计检测提取质量和吸光值（OD260和OD280）。质量检测合格后，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链，于-20 ℃保存备用。
1. 2. 2 ZmADF4基因克隆及其载体构建 根据玉米标准基因组数据库（http：//www.maizegdb.org）中的ADF4基因序列（ZEAMMB73_452408），利用Pri-mer 3.0设计其特异性扩增引物p-ADF4-F/p-ADF4-R和BD-ADF4-F/BD-ADF4-R，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。以玉米B73叶片cDNA为模板进行PCR扩增，参照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase说明配制反应体系50.0 μL：2×Phanta Max Buffer 25.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，DNA聚合酶1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 15 s，67 ℃ 15 s，72 ℃ 24 s，进行34个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收目的片段。
用限制性内切酶BamH I和Hind III对荧光蛋白质粒pRTVnVn进行双酶切，用Nde I和EcoR I对酵母自激活载体pGBKT7进行双酶切，同样对PCR扩增获得的目的片段进行双酶切。分别回收上述酶切产物，通过体外连接的方法把目的片段分别与pRTVnVn和pGBKT7酶切片段连接起来，从而构建pRTVnVn-ZmADF4融合表达载体和pGBKT7-ZmADF4自激活载体，转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取阳性单克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的单克隆菌液保存并提取质粒备用。
1. 2. 3 生物信息学分析 通过ExPASy预测ZmADF4蛋白的理化性质;采用NCBI数据库CDD进行保守结构域预测分析。运用SOPMA和SWISS-MODEL预测ZmADF4蛋白的二、三级结构。
1. 2. 4 亚细胞定位 取黑暗培养至2叶1心期的玉米黄化苗新鲜叶片，提取原生质体，利用原生质体瞬时转化的方法，将质粒pRTVnVn-ZmADF4转化玉米原生质体细胞，置于激光共聚焦显微镜下观察亚细胞定位情况。
1. 2. 5 转录活性分析 将已构建好的载体质粒pGBKT7-ZmADF4+pGADT7、pGBKT7-53（阳性对照）和pGBKT7（阴性对照）质粒分别转化Y2H酵母菌株，并接种于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu/X-α-gal和SD/-Trp-Leu/X-α-gal/AbA培养基上，28 ℃培养2 d，观察酵母菌落生长情况。
1. 2. 6 基因组织特异性表达分析 从玉米标准基因组数据库下载RNA-Seq数据，分析ZmADF4基因在玉米根（播种后7 d，7DAS）、茎（3叶期）、叶（3叶期）、花丝（吐丝期，R1）、花药（吐丝期，R1）、胚（授粉后20 d，20DAP）、胚乳（授粉后20 d，20DAP）和果皮（授粉后20 d，20DAP）的表达特性。
1. 2. 7 逆境胁迫下基因表达模式分析 将玉米种子播于温室盆栽沙土中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗周期下培养。对2周龄生长状态相同的幼苗进行高温胁迫（40 ℃）、低温胁迫（4 ℃）、盐胁迫（0.2 mol/L NaCl）、干旱胁迫（20% PEG-6000）及脱落酸（0.1 mmol/L）处理，以不作处理的幼苗为对照（CK）。分别在处理0、0.5、1.0、2.0、4.0和12.0 h时对3株幼苗进行取样，提取总RNA，反转录合成cDNA。使用2×TSING Master qPCR Mix预混液在荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR。用ZmActin基因作为内参。ZmADF4和ZmActin基因的qRT-PCR引物序列见表1。试验设3个生物學重复，每个反应体系配置3次技术重复。
1. 3 统计分析
采用2-??Ct方法计算相对基因表达量（Livak and Schmittgen，2001），用SPSS 22.0进行显著性分析，并用GraphPad Prism 8.0绘图。
2 结果与分析
2. 1 ZmADF4基因克隆及序列分析结果
以玉米叶片cDNA为模板扩增获得大小约450 bp的特异性条带，其测序结果显示，该条带序列与玉米遗传学和基因组学数据库（MaizeGDB）下载的基因序列（LOC100192897）一致，编码区（CDS）长度为420 bp（图1），编码139个氨基酸残基。
2. 2 ZmADF4蛋白理化性质及结构预测分析结果
ExPASy预测结果显示，ZmADF4蛋白的原子总数为2224个，化学分子式C701H1111N195O210S7，分子量15.855 kD，理论等电点（pI）7.66，蛋白脂肪系数78.63。ZmADF4蛋白亲水性均值（GRAVY）-0.369，不稳定系数44.15，故推测其为不稳定的亲水性蛋白。利用NCBI数据库中的CDD预测ZmADF4蛋白保守结构域，结果（图2）显示其含保守结构域ADF_gelsolin，属于ADF家族成员。ZmADF4蛋白二级结构预测结果（图3）显示，α-螺旋46个，占33.09%，延伸链37个，占26.62%，β-转角9个，占6.47%，无规则卷曲47个，占33.81%。利用SWISS-MODEL预测ZmADF4蛋白三级结构，结果（图4）发现，三级结构与二级结构预测结果相符。 2. 3 ZmADF4蛋白亚细胞定位结果
利用原生质体瞬时转化法将pRTVnVn（阴性对照）和pRTVnVn-ZmADF4融合表达载体转化玉米原生质体细胞中，在激光共聚焦显微镜下观察细胞定位情况，结果发现pRTVnVn在整个细胞内有很强的绿色荧光信号，而pRTVnVn-ZmADF4融合表达载体在玉米原生质体细胞质内有绿色荧光信号，但细胞膜中未发现（图5），推测ZmADF4蛋白定位于细胞质中。
2. 4 ZmADF4基因转录活性分析结果
将pGBKT7-ZmADF4+pGADT7、pGBKT7-53（阳性对照）和pGBKT7（阴性对照）质粒分别转化Y2H酵母菌株，并接种于SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu/X-α-gal和SD/-Trp-Leu/X-α-gal/AbA，培养2 d后观察生长情况，结果（图6）发现，Y2H酵母菌株在SD/-Trp-Leu培养基上正常生长，在SD/-Trp-Leu/X-α-gal培养基上不显示蓝色，在SD/-Trp-Leu/X-α-gal/AbA培养基上未生长，与阴性对照酵母生长状况一致，表明pGBKT7-ZmADF4未发生自激活作用，即ZmADF4基因不具有转录自激活效应。
2. 5 ZmADF4基因在不同发育期组织中表达特性分析结果
为了探索ZmADF4基因在玉米生长发育过程中调控功能，对ZmADF4基因在玉米根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮中的表达情况进行分析，结果（图7）表明ZmADF4基因在不同发育阶段的组织中呈差异性表达，其表达量大小排序为：茎>果皮>叶>根>胚>胚乳>花药>花丝，说明ZmADF4基因功能可能涉及多个方面，但主要参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控。
2. 6 逆境胁迫下ZmADF4基因表达模式分析结果
ZmADF4基因在5个逆境胁迫下不同处理时间的表达模式如图8所示。低温胁迫下，ZmADF4基因在处理1.0和2.0 h时表达量较高，显著高于其他处理时间（P<0.05，下同），但与对照无显著差异（P>0.05，下同）（图8-A）。高温胁迫下，ZmADF4基因随着处理时间的增加呈波动变化，但整体上呈上调表达趋势，在4.0 h时达最大值（图8-B）。干旱胁迫下，处理0.5和1.0 h时ZmADF4基因表达量较对照显著升高，处理1.0 h达最大值，之后显著降低（图8-C）。脱落酸处理下，ZmADF4基因在不同处理时间的表达量显著低于CK，整体上呈下调表达趋势（图8-D）。高盐胁迫下，处理0.5～12.0 h ZmADF4基因表达量呈逐渐降低趋势（图8-E）。可见，ZmADF4基因对高温胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、干旱胁迫和脱落酸处理均有响应，推测玉米ZmADF4基因参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。
3 讨论
肌动蛋白作为一种古老的蛋白，广泛存在于真核生物细胞中，对细胞运动、发育与分化、物质转运、胁迫响应和细胞表面结构维持等均发挥重要作用。在大多数的非植物基因组中只存在1个或2个ADF/cofilin基因，而在植物中则存在庞大的ADF基因家族，导致植物和非植物生物生理功能差异。当细胞在受生物或非生物因素刺激或其发生了形态变化时，细胞中的肌动蛋白骨架会重新排列，ADF/cofilin作為主要的调控因子，在肌动蛋白动力学中发挥重要角色。但目前针对于玉米中ADF家族基因的研究报道较少，因此本研究选择玉米ADF家族成员ZmADF4基因作为研究对象，经蛋白理化性质及结构预测分析发现，ZmADF4基因的CDS序列长度为420 bp，编码139个氨基酸残基，该蛋白含有ADF蛋白家族的保守结构域ADF_gelsolin，定位于细胞质中，与水稻OsADF3基因定位结果一致（Huang et al.，2012），推测二者在功能上可能具有一定的相似性。虽然ADF家族基因在核苷酸序列上高度保守（魏芳和马鸿翔，2011;李红春等，2020），但在不同组织中的表达水平存在明显差异，如Khatun等（2016）研究发现番茄ADF家族基因在花、萼片、花瓣、雄蕊和子房等不同组织的表达水平存在显著差异。本研究也发现，ZmADF4基因在玉米根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮中均能稳定表达，推测此基因参与玉米不同组织的生长和代谢过程，但在不同组织中的表达水平存在明显差异，以茎、果皮和叶片中的表达水平较高，推测ZmADF4基因功能涉及多个方面，但主要参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控。
植物具有抵御逆境胁迫能力，对其生长发育和生产活动具有重大意义。据报道，拟南芥AtADF2、AtADF4和AtADF5基因及水稻OsADF3基因均能提高植物抵抗生物或非生物胁迫的能力（Clement et al.，2009;Tian et al.，2009;叶佳，2010;Huang et al.，2012）。玉米在生长过程中会遇到很多不利于生长的逆境因子，如贫瘠的土壤、高盐、高温、干旱等，均严重影响玉米的生长发育及产量（贾利强等，2020;姚启伦等，2021）。王楠（2016）研究发现，ZmADF5基因与玉米耐旱性相关，将其转入拟南芥后，植株生长加快，生育期缩短，以抵御干旱逆境。本研究对不同逆境胁迫下ZmADF4基因的表达模式进行检测，结果发现，该基因在干旱和高温胁迫诱导下表达上调，与番茄SlADF2、SlADF11和SlADF8基因在干旱和高温胁迫下的表达模式相似（Khatun et al.，2016），推测ZmADF4基因参与调控玉米在逆境胁迫下的生长发育。此外，本研究通过酵母自激活活性检测发现，ZmADF4基因不具备自激活活性，后续可通过酵母文库筛选和酵母双杂交实验验证与ADF4互作的蛋白，或可通过在拟南芥和玉米中过表达或敲除ZmADF4基因，从而进一步探讨ZmADF4基因的抗逆分子调控机制。 4 結论
ZmADF4基因属于ADF基因家族成员，不仅参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控，还参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。
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（責任编辑 陈 燕）