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【摘要】目的：为了研究乳腺癌发生的分子遗传学机理，分离克隆模型鼠乳腺癌组织中特异表达的基因。方法：利用抑制消减杂交技术，结合反向cDNA斑点杂交试验，小鼠乳腺癌组织中分离出与正常乳腺组织差异表达的EST，应用生物信息学方法鉴定所得EST的小鼠同源基因，并分析其与乳腺癌发生的相关性。结果：获得20个在小鼠乳腺癌组织中高表达的，与已知的小鼠基因片段高度同源的基因，及2个与数据库中提交的假想蛋白基因高度同源的基因。结论：利用抑制消减杂交技术，可以高效高通量分析在乳腺癌中特异表达的基因，探讨乳腺癌发生的分子机制。
【关键词】抑制消减杂交技术；乳腺癌；基因
【中图分类号】R737.9【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0021-02
Screening Specific Expressed Genes of Breast Cancer by SSH
WANG YanZGHONGShijunSHAO MinZHANG Qingfeng
(ZUNYi Medical College School of Zhu Hai ,GUANG Dong,Zhu Hai ,519041）
【Abstract】 Objective In order to study the molecular mechanism of breast cancer, to screen the genes differentially expressed in breast cancer. Methods Suppression subtractive hybridization (SSH)combine reverse dot blotting was performed to isolate the differentially expressed genes between breast cancer and normal mammarytissues. A subtractive cDNA library of highly expressed genes in breast tumor tissue was established. Result About 22 differentiallyexpressed genes were obtained. By sequencing and BLAST analysiswe found 2 genes are new genes. Conclusion SSHis an effective method with high specificity to detect specific expressed genes in breastcancer genesisanddevelopment.
【Keywords】SSH；breast cancer；gene
乳腺癌是一种女性多发的恶性肿瘤。我国原属乳腺癌低发区，但近年来也出现明显上升趋势。随着分子生物学的发展,对癌基因和抑癌基因研究的深入,他们已经成为新一代的肿瘤标志物[1,2]。本文以抑制消减杂交技术（SSH），结合反向cDNA斑点杂交试验，从乳腺癌转基因模型小鼠乳腺癌组织和正常乳腺组织中筛选乳腺癌组织高表达基因[3]。以期发现与乳腺癌发生发展相关基因和诊断标志物，为乳腺癌的防治研究奠定基础。
1材料和方法
1.1材料FVB/N-Tg (MMTVneu)202Mul/J转基因小鼠，购于美国The Jackson Laboratory。
1.2主要实验试剂PolyA Ttract mRNA Isolation Systems Kit购自Promega公司；PCR-Select cDNA Subtraction Kit购自Clontech公司；DIG-11-dUTP购于Roche公司。
1.3方法
1.3.1抑制消减杂交按PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书，以转基因小鼠乳腺癌组织作为检测子（tester），正常乳腺组织作为驱赶子（driver），各以2μgmRNA为模板，合成双链cDNA，经Rsa I酶消化，接头连接两轮杂交，两轮PCR，纯化第二轮PCR产物，得到消减产物。每一步都经过试验验证效率。
1.3.2反向cDNA斑点杂交纯化上述PCR产物，经NaOH变性后分两个阵列平行点样于两张尼龙膜上，每个点面积为0.5cm×0.5cm，点加浓缩的PCR产物约200ng (1μL)。经紫外交联固定。用DIG-11-dUTP标记探针，探针为tester和driver的cDNA。经过预杂交、封闭、洗膜等步骤，分别和两种探针共孵育，再进行洗膜、封闭、洗膜，经DAB暗室显色至满意程度。
1.3.3测序及同源性分析挑取经验证的阳性克隆，送Invitrogen公司测序，利用BLAST软件分析。
2结果
2.1总RNA的提取提取总RNA，其D260/D280均大于1.9，琼脂糖电泳可见清晰28s、18s条带（图1）。
2.2消减效率检验未消减对照中的看家基因G3PDH经18个循环扩增几出现扩增条带，而消减后在28个循环后扩增条带刚刚可见（图1），显示经过消减杂交及抑制性PCR，丰度相同的基因得到有效抑制。
2.3PCR检测阳性克隆消减产物经T/A克隆，蓝白斑实验随机筛选了258个阳性克隆，用巢氏PCR的内因物进行PCR检测，剔除无产物的克隆，选取扩增片段在200-1000bp之间，冗余性尽可能低的240个克隆进行进一步分析。部分PCR检测结果如下图（图2）。
2.4反向cDNA斑点杂交结果阳性克隆的PCR产物平行点在尼龙膜上，分别与地高辛标记的tester和driver cDNA探针进行杂交，结果提示多个克隆存在杂交信号的差异（图3）。
2.5序列测定和同源性分析挑取50个差异显示的阳性克隆质粒送去测序，用BLAST软件分析，在50个获得EST中，有27个分别与16个已知基因高度同源，2个EST与假想基因同源。筛选出的已知基因见表1。
3讨论
基因组中基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动。因此，了解疾病病理过程不同阶段基因表达差异，疾病过程与正常发育过程的基因表达差异，对于疾病的诊断与治疗具有重要意义。随着分离组织特异性基因的研究方法不断发展，人们对各种疾病的研究逐渐深入到分子水平。抑制消减杂交是Diatchenk等[4]提出的较代表性差异分析法更简便而有效地寻找差异表达基因的方法，它是以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法，它的特点是假阳性低、敏感性高，对于低丰度的差异表达基因也能有效的分离。本研究应用抑制消减杂交技术结合反向cDNA斑点杂交试验，获得的28个EST中，有27个与16个已知基因高度同源，从表1可以看出，在这些基因中，casein kappa (Csnk)是乳腺组织分化的标记物[5]；casein gamma (Csng)能够被催乳素诱导，transferrin (Trf)有多篇文献报道其在乳腺癌等恶性肿瘤中表达增高、member RAS oncogene family (Rab25)属于RAS原癌基因家族，这些结果提示乳腺癌的发病与发展过程中涉及多个基因的差异表达。此外，在我们获得EST中还有一个假想基因，功能不明，在后面的工作中我将对这个EST进行重点研究。本文首次以小鼠乳腺癌组织为研究对象，筛选出一系列在乳腺癌中特异表达的基因，作为一种重要的资源，将给以后的研究工作带来很大的方便，为进一步研究乳腺癌新的生物标志物及其治疗靶点奠定了基础。
参考文献
[1]吴晓江，陈克能，徐光炜.乳腺癌新的生物标志物及其治疗靶点—HER2及trastuzumab的研究进展[J].中国癌症杂志,2002, 12(2)
[2]Pinkas-Kramarski R, Eilam R, Alroy I, er al. Differential expression of NDF/neuregulin receptors ErbB-3 and ErbB-4 and involvement in inhibition of neuronal differentiation[J]. Oncogene, 1997, 15 (23): 2803-2805
[3]周津，刘芝华，王秀琴,等.抑制消减杂交及反Northern结合高通量筛选食管癌中差异表达基因[J].科学通报,2002,46(3)
[4]Diatchenko L, Lau YF, Campbe11 AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a methodor generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].. Proc Natl Acad Sci U S A,1996, 93 (12): 6025-6030
[5]Earl HM, McIlhinney RA, Wilson P, Gusterson BA, Coombes RC. Immunohistochemical study of beta- and kappa-casein in the human breast and breast carcinomas, using monoclonal antibodies. Cancer Res. 1989 Nov 1;49(21):6070-6
(收稿日期：2009.04.05)
【关键词】抑制消减杂交技术；乳腺癌；基因
【中图分类号】R737.9【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0021-02
Screening Specific Expressed Genes of Breast Cancer by SSH
WANG YanZGHONGShijunSHAO MinZHANG Qingfeng
(ZUNYi Medical College School of Zhu Hai ,GUANG Dong,Zhu Hai ,519041）
【Abstract】 Objective In order to study the molecular mechanism of breast cancer, to screen the genes differentially expressed in breast cancer. Methods Suppression subtractive hybridization (SSH)combine reverse dot blotting was performed to isolate the differentially expressed genes between breast cancer and normal mammarytissues. A subtractive cDNA library of highly expressed genes in breast tumor tissue was established. Result About 22 differentiallyexpressed genes were obtained. By sequencing and BLAST analysiswe found 2 genes are new genes. Conclusion SSHis an effective method with high specificity to detect specific expressed genes in breastcancer genesisanddevelopment.
【Keywords】SSH；breast cancer；gene
乳腺癌是一种女性多发的恶性肿瘤。我国原属乳腺癌低发区，但近年来也出现明显上升趋势。随着分子生物学的发展,对癌基因和抑癌基因研究的深入,他们已经成为新一代的肿瘤标志物[1,2]。本文以抑制消减杂交技术（SSH），结合反向cDNA斑点杂交试验，从乳腺癌转基因模型小鼠乳腺癌组织和正常乳腺组织中筛选乳腺癌组织高表达基因[3]。以期发现与乳腺癌发生发展相关基因和诊断标志物，为乳腺癌的防治研究奠定基础。
1材料和方法
1.1材料FVB/N-Tg (MMTVneu)202Mul/J转基因小鼠，购于美国The Jackson Laboratory。
1.2主要实验试剂PolyA Ttract mRNA Isolation Systems Kit购自Promega公司；PCR-Select cDNA Subtraction Kit购自Clontech公司；DIG-11-dUTP购于Roche公司。
1.3方法
1.3.1抑制消减杂交按PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书，以转基因小鼠乳腺癌组织作为检测子（tester），正常乳腺组织作为驱赶子（driver），各以2μgmRNA为模板，合成双链cDNA，经Rsa I酶消化，接头连接两轮杂交，两轮PCR，纯化第二轮PCR产物，得到消减产物。每一步都经过试验验证效率。
1.3.2反向cDNA斑点杂交纯化上述PCR产物，经NaOH变性后分两个阵列平行点样于两张尼龙膜上，每个点面积为0.5cm×0.5cm，点加浓缩的PCR产物约200ng (1μL)。经紫外交联固定。用DIG-11-dUTP标记探针，探针为tester和driver的cDNA。经过预杂交、封闭、洗膜等步骤，分别和两种探针共孵育，再进行洗膜、封闭、洗膜，经DAB暗室显色至满意程度。
1.3.3测序及同源性分析挑取经验证的阳性克隆，送Invitrogen公司测序，利用BLAST软件分析。
2结果
2.1总RNA的提取提取总RNA，其D260/D280均大于1.9，琼脂糖电泳可见清晰28s、18s条带（图1）。
2.2消减效率检验未消减对照中的看家基因G3PDH经18个循环扩增几出现扩增条带，而消减后在28个循环后扩增条带刚刚可见（图1），显示经过消减杂交及抑制性PCR，丰度相同的基因得到有效抑制。
2.3PCR检测阳性克隆消减产物经T/A克隆，蓝白斑实验随机筛选了258个阳性克隆，用巢氏PCR的内因物进行PCR检测，剔除无产物的克隆，选取扩增片段在200-1000bp之间，冗余性尽可能低的240个克隆进行进一步分析。部分PCR检测结果如下图（图2）。
2.4反向cDNA斑点杂交结果阳性克隆的PCR产物平行点在尼龙膜上，分别与地高辛标记的tester和driver cDNA探针进行杂交，结果提示多个克隆存在杂交信号的差异（图3）。
2.5序列测定和同源性分析挑取50个差异显示的阳性克隆质粒送去测序，用BLAST软件分析，在50个获得EST中，有27个分别与16个已知基因高度同源，2个EST与假想基因同源。筛选出的已知基因见表1。
3讨论
基因组中基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动。因此，了解疾病病理过程不同阶段基因表达差异，疾病过程与正常发育过程的基因表达差异，对于疾病的诊断与治疗具有重要意义。随着分离组织特异性基因的研究方法不断发展，人们对各种疾病的研究逐渐深入到分子水平。抑制消减杂交是Diatchenk等[4]提出的较代表性差异分析法更简便而有效地寻找差异表达基因的方法，它是以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法，它的特点是假阳性低、敏感性高，对于低丰度的差异表达基因也能有效的分离。本研究应用抑制消减杂交技术结合反向cDNA斑点杂交试验，获得的28个EST中，有27个与16个已知基因高度同源，从表1可以看出，在这些基因中，casein kappa (Csnk)是乳腺组织分化的标记物[5]；casein gamma (Csng)能够被催乳素诱导，transferrin (Trf)有多篇文献报道其在乳腺癌等恶性肿瘤中表达增高、member RAS oncogene family (Rab25)属于RAS原癌基因家族，这些结果提示乳腺癌的发病与发展过程中涉及多个基因的差异表达。此外，在我们获得EST中还有一个假想基因，功能不明，在后面的工作中我将对这个EST进行重点研究。本文首次以小鼠乳腺癌组织为研究对象，筛选出一系列在乳腺癌中特异表达的基因，作为一种重要的资源，将给以后的研究工作带来很大的方便，为进一步研究乳腺癌新的生物标志物及其治疗靶点奠定了基础。
参考文献
[1]吴晓江，陈克能，徐光炜.乳腺癌新的生物标志物及其治疗靶点—HER2及trastuzumab的研究进展[J].中国癌症杂志,2002, 12(2)
[2]Pinkas-Kramarski R, Eilam R, Alroy I, er al. Differential expression of NDF/neuregulin receptors ErbB-3 and ErbB-4 and involvement in inhibition of neuronal differentiation[J]. Oncogene, 1997, 15 (23): 2803-2805
[3]周津，刘芝华，王秀琴,等.抑制消减杂交及反Northern结合高通量筛选食管癌中差异表达基因[J].科学通报,2002,46(3)
[4]Diatchenko L, Lau YF, Campbe11 AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a methodor generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].. Proc Natl Acad Sci U S A,1996, 93 (12): 6025-6030
[5]Earl HM, McIlhinney RA, Wilson P, Gusterson BA, Coombes RC. Immunohistochemical study of beta- and kappa-casein in the human breast and breast carcinomas, using monoclonal antibodies. Cancer Res. 1989 Nov 1;49(21):6070-6
(收稿日期：2009.04.05)