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摘要：分别采用木瓜蛋白酶和溶壁酶降解金针菇菇根水提后的多糖，以提取还原性寡糖，并通过单因素试验和正交试验确定适合两种酶的最佳提取工艺。结果表明，木瓜蛋白酶降解菇根多糖的最佳工艺条件为酶解0.5 h、酶底比为4.5%、pH值6.0、温度为35℃；溶壁酶的最佳工艺条件为酶解1.5 h、酶底比为2.0%、pH值5.0、温度为50℃。采用不同的酶降解金针菇多糖，其还原性寡糖的得率不同，其中，溶壁酶降解所得还原性寡糖得率为6.8768%，木瓜蛋白酶降解所得还原性寡糖得率为6.1368%。
关键词：金针菇菇根；多糖；酶解；寡糖
中图分类号：S646.1+5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0114-05
AbstractIn order to obtain oligosaccharides， the papain and lywallzyme were used respectively to degrade the polysaccharides extracted from enoki mushroom root with water. The optimum enzymolysis conditions for two enzymes were optimized through single-factor experiment and orthogonal test. The results showed that the optimum conditions for papain were enzymolysis for 0.5 hours， the ratio of enzyme to substrate as 4.5%， pH 6.0 and the temperature as 35℃. The optimum conditions for lywallzyme were enzymolysis for 1.5 hours， the ratio of enzyme to substrate as 2.0%， pH 5.0 and the temperature as 50℃. Using different enzymes to degrade enoki mushroom polysaccharides， the production of oligosaccharides was different. The yield of reducing oligosaccharide obtained by lywallzyme and papain were 6.8768% and 6.1368% respectively.
Key wordsEnoki mushroom root； Polysaccharides； Enzymolysis； Oligosaccharide
金针菇（Flammulina velutipes）又名毛柄金钱菌、冬菇，属担子菌亚门层菌纲伞菌目口蘑科金钱菌属1。金针菇盖滑、柄脆、味鲜，是古今中外著名食用菌之一，也是当今市场上十分走俏的天然保健食品之一2。金针菇在大自然中分布广泛，是一种比较普遍的食用菌，具有较高的药理价值。金针菇寡糖是金针菇的主要活性成分之一，寡糖及其衍生物是一类重要的生物活性物质，具有很强的抗病毒和抗炎活性，能促进双歧杆菌生长，是生物体内重要的信息物质。寡糖类物质可通过天然提取、多糖水解和人工合成等方法获得 [3，4，酶法降解条件温和、污染小、选择性好、产物比较单一而且安全。由于食药用菌含有的聚糖类物质尤为丰富，因此，酶降解金针菇菇根多糖生产寡糖在工业化上极有前途。本研究采用食品级酶制剂对热水提取后的金针菇多糖进行降解，旨在降低水提多糖的分子量，促进小分子量多糖的进一步溶出，提高其寡糖得率5，为生物活性寡糖的进一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
金针菇菇根，购于山东嘉元食用菌科技有限公司；溶壁酶购于Sigma公司；胰酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶购于上海源叶生物科技有限公司；95%食用乙醇购自山东三杯酒精有限公司；3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、亚硫酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、硫酸均为市售分析纯药品。
1.2仪器与设备
紫外可见分光光度计（T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司），高速多功能粉碎机（JP-350A-2，上海久品工贸有限公司），旋转蒸发仪（IKA RV10，上海人和科学仪器有限公司），高速离心机（5810R，Eppendorf），冷冻干燥机（LGJ-1C-54，北京亚泰科隆仪器技术有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1葡萄糖标准曲线的绘制6准确称取干燥后的葡萄糖100 mg，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。按照表1进行配制，将各管混匀，沸水浴加热10～15 min，取出置于冰水中迅速冷却至室温，蒸馏水定容至25 mL，混匀。在540 nm处，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.2原料预处理将金针菇菇根去除杂质后放入60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过50目筛备用。取金针菇菇根粉，加入6倍95%乙醇浸泡过夜，过滤，重复操作2次。浸泡后的菇根粉置阴凉通风处风干备用7。
1.3.3金针菇菇根水提多糖的制备8将预处理的菇根粉以1∶20的比例加入蒸馏水，90℃水浴加热1 h，提取3次。离心，合并上清液，旋转蒸发仪浓缩6倍。加入4倍体积的95%乙醇至其浓度为80%，离心，去上清，用蒸馏水重新溶解沉淀，水浴锅中蒸发掉乙醇。根据Sevag方法除蛋白，浓缩液加入1/4体积的氯仿、正丁醇（4∶1），充分摇匀，离心，去除蛋白质层和下层，重复多次直到蛋白质去除。将所得溶液透析，去除其中的寡糖和盐离子。 1.3.4 酶对金针菇菇根水提多糖的降解9～11根据每种酶作用的pH值范围，用缓冲液将金针菇菇根水提多糖配制至浓度为10 mg/mL。分别对每种酶的pH值、温度、酶底比和时间进行单因素最优条件的筛选，在此基础上进行L9（34）的正交试验。单因素试验每个处理重复3次，多重比较采用SSR法，正交试验每个处理重复2次。
1.3.5寡糖的测定采用DNS法进行寡糖含量测定。取1 mL待测液、1 mL水、1.5 mL DNS试剂混匀，对照用1 mL蒸馏水代替1 mL待测液。沸水浴加热10～15 min，取出置于冰水中迅速冷却至室温，蒸馏水定容至25 mL，混匀。在540 nm处，用对照管调零，分别读取各管的吸光度。
2结果与分析
从图1中可以看出葡萄糖含量与吸光度之间的关系，相关系数R2=0.999，表明葡萄糖在设定的浓度内与吸光度呈良好的线性关系，符合要求，该方程可以用于还原糖的测定。
2.2溶壁酶对多糖的水解
2.2.1酶解pH值、温度、酶底比和酶解时间的影响由图2（a）可以看出，随着pH值的增加，还原性寡糖得率先增加后降低，当pH值为4.5时，寡糖提取率最高；由图2（b）可以看出，温度45℃时达到了酶的最适反应温度，此时溶壁酶作用最彻底；由图2（c）可以看出，随着酶底比的增大，反应液中多糖的降解率升高，当酶底比为2.0%，溶壁酶达到最适添加量，寡糖提取率最高；由图2（d）可以看出，随着反应时间的延长，反应逐步彻底，当反应时间为1 h时，寡糖提取率最高，此时反应液中寡糖含量最高。
1.5 h、酶底比为2.0%、pH值为5.0、温度为50℃。极差分析表明，影响金针菇菇根寡糖提取率因素的主次顺序为：C>A>B>D，即pH值>酶解时间>酶底比>温度（表2）。验证试验结果表明在此条件下，溶壁酶提取金针菇菇根寡糖得率为6.8768%。
2.3木瓜蛋白酶对多糖的水解
2.3.1酶解pH值、温度、酶底比和酶解时间的影响由图3（a）可以看出，随着pH值的增加，还原性寡糖得率先增加后降低，当pH值为5.5时，寡糖提取率最高；由图3（b）可以看出，温度为40℃时，达到了酶的最适反应温度，此时木瓜蛋白酶作用最彻底；由图3（c）可以看出，随着酶底比的增大，反应液中多糖的降解率升高，当酶底比达到4.5%，木瓜蛋白酶达最适添加量；由图3（d）可以看出，随着反应时间延长，反应逐步彻底，当反应时间为1 h时，寡糖提取率最高，此时反应液中寡糖含量最高。
2.3.2木瓜蛋白酶降解金针菇菇根多糖正交试验结果通过L9（34）正交试验确定了木瓜蛋白酶降解多糖的最佳工艺条件是A1B2C3D1组合，即酶解0.5 h、酶底比为4.5%、pH值为6.0、温度为35℃。极差分析表明，影响金针菇菇根寡糖提取率因素的主次顺序为：C>B>D>A，即pH值>酶底比>温度>酶解时间（表3）。验证试验结果表明，在此条件下木瓜蛋白酶提取金针菇菇根寡糖得率为6.1368%。
3结论
酶解法较传统的化学法具有底物专一性强、产物特异性高、反应条件温和等优点，能够保证酶解产物结构不被破坏，从而保证寡糖产品的稳定性，使高纯度寡糖的大量制备成为可能12。酶法处理可以提高寡糖提取率、减少能源消耗、缩短提取时间。金针菇是著名的食药两用菌，其寡糖具有广泛的生物学功能，市场开发前景巨大13，14， 因此，探索更为高效、经济、可靠的提取方法对金针菇寡糖的研究开发具有重要的现实意义。
本研究采用不同酶降解金针菇多糖，以还原糖的释放量为指标，并用正交试验进行优化，得到了最佳降解工艺。溶壁酶降解金针菇多糖最佳工艺条件是酶解1.5 h、酶底比2.0%、pH值5.0、温度50℃，在此条件下，金针菇菇根寡糖得率为6.8768%；木瓜蛋白酶降解金针菇多糖最佳工艺条件是酶解0.5 h、酶底比 4.5%、pH值6.0、温度35℃，在此条件下，金针菇菇根寡糖得率为6.1368%。本研究分析得出，酶法降解多糖制得寡糖，产物具有分子量分布窄、均一性好等优点。该研究结果将为制备金针菇寡糖以及小分子多糖在医学和功能性食品上应用等方面奠定基础。
参考文献：
[1]孔晓雪，安辛欣，赵立艳，等. 金针菇水溶性多糖物理提取工艺及优化[J]. 食品科学，2010，31（24）：230-235.
[2]黄良水，金群力.我国金针菇产业发展现状与前景展望[J]. 浙江农业科学，2011（6）：1252-1256.
[3]蒋忠平，张安强，孙培龙. 植物来源寡糖的研究进展（综述）[J].浙江食用菌，2009，17（2）：36-39.
[4]蒋忠平. 猴头菌子实体寡糖的提取、分离及结构研究[D].杭州：浙江工业大学，2009.
[5]欧阳乐，王振宇. 酶法降解黑木耳多糖工艺研究[J]. 中国林副特产，2012（5）：20-23.
[6]武长飞，张杰，刘远青，等. 金针菇菇柄多糖提取工艺的优化[J]. 食品与机械，2013，29（5）：169-172.
[7]王芳，丁祥，宋波，等. 珍稀食药用真菌猴头菇寡聚糖的分离纯化及抗氧化活性的研究[J]. 四川大学学报：自然科学版，2013，50（6）：1339-1346.
[8]黄家莉，李明元，徐锦，等. 金针菇加工副产物水溶性多糖提取工艺研究[J]. 食用菌，2012（3）：62-63，74.
[9]王丽威，郭旭颖，陈梁成，等. 水浴法和微波法提取金针菇下脚料多糖的优化及比较研究[J]. 食品工业科技，2012，33（8）：322-325.
[10]陈贵堂，赵立艳，刘玮，等. 响应面优化酶法辅助提取金针菇根部多糖的工艺研究[J]. 食品工业科技，2013（24）：209-213，228. [11]黄琼，丁玲. 微波协同酶法提取金针菇多糖工艺的优化[J]. 食品与机械，2013（1）：128-130，166.
[12]Kang J，Wang H Q，Chen R Y. Studies on the constituents of the mycelia produced from fermented culture of Flammulina velutipes [J]. International Journal of Medicinal Mushrooms，2003，5（4）：391-396.
[13]冯伟林，蔡为明，金群力，等.金针菇生长发育期间相关胞外酶的活性变化研究[J]. 浙江农业学报，2012，24（3）：430-433.
[14]Willberg D M，Lang P S，Hochemer R H， et al.Degradation of 4-chlorophenol，3，4-dichloroaniline，and 2，4，6-trinitrotoluene in an electrohydraulic discharge reactor [J]. Environ. Sci. Technol.，1996（30）：2526-2534.
[3]Luo J P，Liu X H，Tian Q，et al.Disposable bioluminescence-based biosensor for detection of bacterial count in food [J].Analytical Biochemistry，2009，394（1）：1-6.
[4]Hansen D，Benner D，Hilgenhner M，et al. ATP measurement as method to monitor the quality of reprocessing flexible endoscopes[J]. German Med. Sci.， 2004， 2：4.
[5]金振华，陆建荣，杨建. 含荧光素酶基因的新型重组体DNA及荧光素酶的生产方法[P].中国：CN93117156.3，1993-09-11.
[6]刘俊江，熊征， 刘良英. ATP荧光测定珠三角地区散装瓜子表面细菌总数[J].卫生研究，2013（5）：854-855.
[7]王美容，向玲，林霄，等. 应用ATP生物荧光法对物体表面细菌含量快速检测[J].中国消毒学杂志，2009（1）：26.
[8]陆烨，胡国庆，陆龙喜，等. 应用ATP生物荧光法对疫源地消毒效果评价的研究[J]. 中国卫生检验杂志，2010（5）：1090-1091.
[9]王绍鑫，周艳琴， 张帆，等. 医疗机构ATP荧光检测和实验室细菌计数法检测结果比较[J].江苏预防科学，2013（2）：21-23.
[10]廖如燕， 陈胤瑜，华志涛，等. ATP 生物荧光检测法快速检测水细菌污染的评价[J].旅行医学科学，2011（6）：5-11.
关键词：金针菇菇根；多糖；酶解；寡糖
中图分类号：S646.1+5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0114-05
AbstractIn order to obtain oligosaccharides， the papain and lywallzyme were used respectively to degrade the polysaccharides extracted from enoki mushroom root with water. The optimum enzymolysis conditions for two enzymes were optimized through single-factor experiment and orthogonal test. The results showed that the optimum conditions for papain were enzymolysis for 0.5 hours， the ratio of enzyme to substrate as 4.5%， pH 6.0 and the temperature as 35℃. The optimum conditions for lywallzyme were enzymolysis for 1.5 hours， the ratio of enzyme to substrate as 2.0%， pH 5.0 and the temperature as 50℃. Using different enzymes to degrade enoki mushroom polysaccharides， the production of oligosaccharides was different. The yield of reducing oligosaccharide obtained by lywallzyme and papain were 6.8768% and 6.1368% respectively.
Key wordsEnoki mushroom root； Polysaccharides； Enzymolysis； Oligosaccharide
金针菇（Flammulina velutipes）又名毛柄金钱菌、冬菇，属担子菌亚门层菌纲伞菌目口蘑科金钱菌属1。金针菇盖滑、柄脆、味鲜，是古今中外著名食用菌之一，也是当今市场上十分走俏的天然保健食品之一2。金针菇在大自然中分布广泛，是一种比较普遍的食用菌，具有较高的药理价值。金针菇寡糖是金针菇的主要活性成分之一，寡糖及其衍生物是一类重要的生物活性物质，具有很强的抗病毒和抗炎活性，能促进双歧杆菌生长，是生物体内重要的信息物质。寡糖类物质可通过天然提取、多糖水解和人工合成等方法获得 [3，4，酶法降解条件温和、污染小、选择性好、产物比较单一而且安全。由于食药用菌含有的聚糖类物质尤为丰富，因此，酶降解金针菇菇根多糖生产寡糖在工业化上极有前途。本研究采用食品级酶制剂对热水提取后的金针菇多糖进行降解，旨在降低水提多糖的分子量，促进小分子量多糖的进一步溶出，提高其寡糖得率5，为生物活性寡糖的进一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
金针菇菇根，购于山东嘉元食用菌科技有限公司；溶壁酶购于Sigma公司；胰酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶购于上海源叶生物科技有限公司；95%食用乙醇购自山东三杯酒精有限公司；3，5-二硝基水杨酸、葡萄糖、亚硫酸钠、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、硫酸均为市售分析纯药品。
1.2仪器与设备
紫外可见分光光度计（T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司），高速多功能粉碎机（JP-350A-2，上海久品工贸有限公司），旋转蒸发仪（IKA RV10，上海人和科学仪器有限公司），高速离心机（5810R，Eppendorf），冷冻干燥机（LGJ-1C-54，北京亚泰科隆仪器技术有限公司）。
1.3试验方法
1.3.1葡萄糖标准曲线的绘制6准确称取干燥后的葡萄糖100 mg，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。按照表1进行配制，将各管混匀，沸水浴加热10～15 min，取出置于冰水中迅速冷却至室温，蒸馏水定容至25 mL，混匀。在540 nm处，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.2原料预处理将金针菇菇根去除杂质后放入60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过50目筛备用。取金针菇菇根粉，加入6倍95%乙醇浸泡过夜，过滤，重复操作2次。浸泡后的菇根粉置阴凉通风处风干备用7。
1.3.3金针菇菇根水提多糖的制备8将预处理的菇根粉以1∶20的比例加入蒸馏水，90℃水浴加热1 h，提取3次。离心，合并上清液，旋转蒸发仪浓缩6倍。加入4倍体积的95%乙醇至其浓度为80%，离心，去上清，用蒸馏水重新溶解沉淀，水浴锅中蒸发掉乙醇。根据Sevag方法除蛋白，浓缩液加入1/4体积的氯仿、正丁醇（4∶1），充分摇匀，离心，去除蛋白质层和下层，重复多次直到蛋白质去除。将所得溶液透析，去除其中的寡糖和盐离子。 1.3.4 酶对金针菇菇根水提多糖的降解9～11根据每种酶作用的pH值范围，用缓冲液将金针菇菇根水提多糖配制至浓度为10 mg/mL。分别对每种酶的pH值、温度、酶底比和时间进行单因素最优条件的筛选，在此基础上进行L9（34）的正交试验。单因素试验每个处理重复3次，多重比较采用SSR法，正交试验每个处理重复2次。
1.3.5寡糖的测定采用DNS法进行寡糖含量测定。取1 mL待测液、1 mL水、1.5 mL DNS试剂混匀，对照用1 mL蒸馏水代替1 mL待测液。沸水浴加热10～15 min，取出置于冰水中迅速冷却至室温，蒸馏水定容至25 mL，混匀。在540 nm处，用对照管调零，分别读取各管的吸光度。
2结果与分析
从图1中可以看出葡萄糖含量与吸光度之间的关系，相关系数R2=0.999，表明葡萄糖在设定的浓度内与吸光度呈良好的线性关系，符合要求，该方程可以用于还原糖的测定。
2.2溶壁酶对多糖的水解
2.2.1酶解pH值、温度、酶底比和酶解时间的影响由图2（a）可以看出，随着pH值的增加，还原性寡糖得率先增加后降低，当pH值为4.5时，寡糖提取率最高；由图2（b）可以看出，温度45℃时达到了酶的最适反应温度，此时溶壁酶作用最彻底；由图2（c）可以看出，随着酶底比的增大，反应液中多糖的降解率升高，当酶底比为2.0%，溶壁酶达到最适添加量，寡糖提取率最高；由图2（d）可以看出，随着反应时间的延长，反应逐步彻底，当反应时间为1 h时，寡糖提取率最高，此时反应液中寡糖含量最高。
1.5 h、酶底比为2.0%、pH值为5.0、温度为50℃。极差分析表明，影响金针菇菇根寡糖提取率因素的主次顺序为：C>A>B>D，即pH值>酶解时间>酶底比>温度（表2）。验证试验结果表明在此条件下，溶壁酶提取金针菇菇根寡糖得率为6.8768%。
2.3木瓜蛋白酶对多糖的水解
2.3.1酶解pH值、温度、酶底比和酶解时间的影响由图3（a）可以看出，随着pH值的增加，还原性寡糖得率先增加后降低，当pH值为5.5时，寡糖提取率最高；由图3（b）可以看出，温度为40℃时，达到了酶的最适反应温度，此时木瓜蛋白酶作用最彻底；由图3（c）可以看出，随着酶底比的增大，反应液中多糖的降解率升高，当酶底比达到4.5%，木瓜蛋白酶达最适添加量；由图3（d）可以看出，随着反应时间延长，反应逐步彻底，当反应时间为1 h时，寡糖提取率最高，此时反应液中寡糖含量最高。
2.3.2木瓜蛋白酶降解金针菇菇根多糖正交试验结果通过L9（34）正交试验确定了木瓜蛋白酶降解多糖的最佳工艺条件是A1B2C3D1组合，即酶解0.5 h、酶底比为4.5%、pH值为6.0、温度为35℃。极差分析表明，影响金针菇菇根寡糖提取率因素的主次顺序为：C>B>D>A，即pH值>酶底比>温度>酶解时间（表3）。验证试验结果表明，在此条件下木瓜蛋白酶提取金针菇菇根寡糖得率为6.1368%。
3结论
酶解法较传统的化学法具有底物专一性强、产物特异性高、反应条件温和等优点，能够保证酶解产物结构不被破坏，从而保证寡糖产品的稳定性，使高纯度寡糖的大量制备成为可能12。酶法处理可以提高寡糖提取率、减少能源消耗、缩短提取时间。金针菇是著名的食药两用菌，其寡糖具有广泛的生物学功能，市场开发前景巨大13，14， 因此，探索更为高效、经济、可靠的提取方法对金针菇寡糖的研究开发具有重要的现实意义。
本研究采用不同酶降解金针菇多糖，以还原糖的释放量为指标，并用正交试验进行优化，得到了最佳降解工艺。溶壁酶降解金针菇多糖最佳工艺条件是酶解1.5 h、酶底比2.0%、pH值5.0、温度50℃，在此条件下，金针菇菇根寡糖得率为6.8768%；木瓜蛋白酶降解金针菇多糖最佳工艺条件是酶解0.5 h、酶底比 4.5%、pH值6.0、温度35℃，在此条件下，金针菇菇根寡糖得率为6.1368%。本研究分析得出，酶法降解多糖制得寡糖，产物具有分子量分布窄、均一性好等优点。该研究结果将为制备金针菇寡糖以及小分子多糖在医学和功能性食品上应用等方面奠定基础。
参考文献：
[1]孔晓雪，安辛欣，赵立艳，等. 金针菇水溶性多糖物理提取工艺及优化[J]. 食品科学，2010，31（24）：230-235.
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[4]蒋忠平. 猴头菌子实体寡糖的提取、分离及结构研究[D].杭州：浙江工业大学，2009.
[5]欧阳乐，王振宇. 酶法降解黑木耳多糖工艺研究[J]. 中国林副特产，2012（5）：20-23.
[6]武长飞，张杰，刘远青，等. 金针菇菇柄多糖提取工艺的优化[J]. 食品与机械，2013，29（5）：169-172.
[7]王芳，丁祥，宋波，等. 珍稀食药用真菌猴头菇寡聚糖的分离纯化及抗氧化活性的研究[J]. 四川大学学报：自然科学版，2013，50（6）：1339-1346.
[8]黄家莉，李明元，徐锦，等. 金针菇加工副产物水溶性多糖提取工艺研究[J]. 食用菌，2012（3）：62-63，74.
[9]王丽威，郭旭颖，陈梁成，等. 水浴法和微波法提取金针菇下脚料多糖的优化及比较研究[J]. 食品工业科技，2012，33（8）：322-325.
[10]陈贵堂，赵立艳，刘玮，等. 响应面优化酶法辅助提取金针菇根部多糖的工艺研究[J]. 食品工业科技，2013（24）：209-213，228. [11]黄琼，丁玲. 微波协同酶法提取金针菇多糖工艺的优化[J]. 食品与机械，2013（1）：128-130，166.
[12]Kang J，Wang H Q，Chen R Y. Studies on the constituents of the mycelia produced from fermented culture of Flammulina velutipes [J]. International Journal of Medicinal Mushrooms，2003，5（4）：391-396.
[13]冯伟林，蔡为明，金群力，等.金针菇生长发育期间相关胞外酶的活性变化研究[J]. 浙江农业学报，2012，24（3）：430-433.
[14]Willberg D M，Lang P S，Hochemer R H， et al.Degradation of 4-chlorophenol，3，4-dichloroaniline，and 2，4，6-trinitrotoluene in an electrohydraulic discharge reactor [J]. Environ. Sci. Technol.，1996（30）：2526-2534.
[3]Luo J P，Liu X H，Tian Q，et al.Disposable bioluminescence-based biosensor for detection of bacterial count in food [J].Analytical Biochemistry，2009，394（1）：1-6.
[4]Hansen D，Benner D，Hilgenhner M，et al. ATP measurement as method to monitor the quality of reprocessing flexible endoscopes[J]. German Med. Sci.， 2004， 2：4.
[5]金振华，陆建荣，杨建. 含荧光素酶基因的新型重组体DNA及荧光素酶的生产方法[P].中国：CN93117156.3，1993-09-11.
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[7]王美容，向玲，林霄，等. 应用ATP生物荧光法对物体表面细菌含量快速检测[J].中国消毒学杂志，2009（1）：26.
[8]陆烨，胡国庆，陆龙喜，等. 应用ATP生物荧光法对疫源地消毒效果评价的研究[J]. 中国卫生检验杂志，2010（5）：1090-1091.
[9]王绍鑫，周艳琴， 张帆，等. 医疗机构ATP荧光检测和实验室细菌计数法检测结果比较[J].江苏预防科学，2013（2）：21-23.
[10]廖如燕， 陈胤瑜，华志涛，等. ATP 生物荧光检测法快速检测水细菌污染的评价[J].旅行医学科学，2011（6）：5-11.