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摘要：
ATP荧光检测仪是近年来的新生产物，可以通过荧光值快速反映出细菌菌落数。本研究以金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） 、大肠杆菌（8099）为试材，培养24 h后，各自稀释11个梯度（10倍稀释），并进行细菌计数；同时采用ATP荧光仪对每一个稀释梯度进行荧光检测。以lg（菌落数）为横坐标（x），以ATP荧光值（y）为纵坐标，分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合，发现二者之间关系符合指数曲线，相关系数均接近0.9或以上。以屠宰场的要求“<1 000荧光值为合格，>2 000荧光值为不合格”为实例进行使用指导：当实际lg（菌落数）>10.04时，得出不合格的结论；当实际lg（菌落数）<8.27时，得出合格的结论；但如果8.27<实际lg（菌落数）<10.04时，则容易出现误判。结论认为ATP荧光检测可以在一定程度上代替细菌常规检测，并应用于实际生产。
关键词：ATP荧光检测仪；细菌；常规计数；相关性
中图分类号：Q93-331文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0111-04
AbstractATP fluorescence detector， as a new technical device， can rapidly reflect the amounts of bacterial colonies via fluorescence value. Selecting Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Escherichia coli 8099 as materials， the number of colonies were counted after cultured for 24 hours and diluted to 11 gradients （10 times dilution）. Meanwhile， the fluorescence value of each dilution was detected by ATP fluorescence detector. On the basis of these results， with lg（CFU） as abscissa （x） and ATP fluorescence value as ordinate （y）， the linear fitting， logarithm fitting and exponent fitting were conducted；it was found that the relationship between lg（CFU） and ATP fluorescence value was in accordance with exponential curve with the correlation coefficient of close to 0.9 or above. According to the requirement of slaughterhouse， if the fluorescence value was less than 1 000， it is qualified； if fluorescence value was greater than 2 000， it is not qualified. It could be explained as follows. If actual lg（CFU） was greater than 10.04， it should be unqualified； if actual lg （CFU） was less than 8.27， it should be qualified. But when actual lg（CFU） was between 8.27 and 10.04， it should be prone to misjudge. Ultimately， to some extent， the ATP fluorescence detection was able to replace the bacteria conventional detection to be used in actual production.
Key wordsATP fluorescence detector； Bacteria； Conventional count； Correlation
在细菌总数的检测中，传统的培养法由于检测时间较长，已经不能满足食品企业实施HACCP体系时实时监控的要求1。20世纪80年代，英国首先研制出ATP 检测系统，随后发展到欧洲、美国和日本。应用范围涉及食品加工等行业，检测内容包括生物和食品残渣2；快速检测宇宙空间水系统中微生物量也是该技术较早应用的领域之一3；也有将ATP （三磷酸腺苷）生物荧光法引入到医疗机构器械清洗前、后残留物检测4。在我国，基于国家发明专利“含虫光素基因的新型菌株及虫光素酶的生产方法”5的一种荧光检测仪逐步被应用，其能通过ATP荧光仪与Ultrasnap配合使用，采用生物发光技术检测残留的ATP作为表面清洁度的指标。本研究即通过ATP计数与细菌常规检测两种方法互相印证，探索二者之间的相关性，并举例得出几个节点数据指导实践应用。
1材料与方法
1.1试剂与设备
无菌蒸馏水；营养肉汤（NB）；营养琼脂（按GB/T47899.28-2003配制）；试管；培养皿；移液枪；数显气浴恒温震荡器；超净工作台；恒温培养箱；电动混合器；3M ATP荧光检测仪。
1.2试验菌悬液制备
试验菌为金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） 、大肠杆菌（8099） ，购自中国兽医药品监察所。取各冻干菌种管，在无菌操作下，用毛细吸管向其加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取少许滴入含 5.0～10.0 mL 营养肉汤的试管，置37℃培养24 h。每株菌培养2组。每组从原液开始用含1 g/L胰蛋白胨生理盐水进行10倍梯度稀释，直至10-10，共11个稀释浓度。 1.3细菌计数试验
1.3.1常规检测法于超净工作台将冷却至40～45℃的熔化营养琼脂培养基倾注于平皿中，每平皿15～20 mL。每组取11个稀释度菌悬液涂板培养，接种体积为1 mL，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养16～48 h，观察并进行细菌计数。每个稀释度重复3皿。
1.3.2ATP计数仪检测法将棉拭子分别浸入每组11个稀释度菌悬液3～4 s，然后将棉拭子插入检测管，用拇指和中指捏住球管，从吸阀处折断。轻挤球管2次，挤出球管内液体。再将检测管放入发光仪中，盖上盖子，开始检测，根据数显仪判读结果。对所有菌悬液的所有梯度均用ATP荧光计数仪进行检测，并记录数据。
1.4相关性分析
用Microsoft Excel进行相关性分析，以lg（细菌数）为横坐标，以ATP荧光值（RLU）为纵坐标，分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合。
2结果与分析
2.1不同菌落数对应的ATP荧光值
由表1看出，该试验中最少菌落数（32～200个/mL）也能读出荧光值，对应lg（菌落数）为1.51～2.3。而根据仪器公司提供的参考限量标准，最高要求的乳品、果汁等高风险产品加工表面合格菌要求RLU值<150，由此说明该仪器具有较好的灵敏度。同时发现，随着菌落数的降低，RLU值也在降低，二者呈正相关关系。
2.2菌落数与ATP荧光值的不同曲线拟合研究
以lg（菌落数）为横坐标（x），以ATP荧光值（y）为纵坐标，分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合，相关系数见表2。因为RLU值与lg（菌落数）呈正相关关系，所以不采用多项式拟合。由表2可见，线性与对数相关系数均在0.8以下，没有统计学意义；乘幂拟合的相关系数较好，但是所有数值均低于指数拟合。大肠杆菌与金黄色葡萄球菌指数相关系数相当，均集中在0.9左右，可见该方法对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均有效。
3讨论与结论
ATP荧光计数仪还是一个前沿产物，已有部分研究证明其可以在一定程度上代替细菌常规检测6～8。但从数值上看，二者仍然存在一定差异，例如王绍鑫等（2013）9发现，ATP荧光检测总合格率为61.30%，实验室细菌计数法总合格率为83.70%。在数据分析方面，刘俊江等（2013）6认为菌落总数对数值与发光强度对数值呈线性关系，y=0.61032x+0.07459，相关系数R2=0.96073。而本研究发现在4个试验中，菌落数与荧光值线性相关系数很低，而指数相关系数较高，在0.89～0.96之间。深入对比发现，本试验构建的是梯度稀释模型，菌落数跨度从102～1013，而很多研究仅是检测现实样品，其菌落数多数集中在102～105 10。这从侧面证明，菌落数与荧光值线性相关系数仅在一定范围内有效，而扩大到细菌可能的最大浓度发现，二者基本呈指数相关。结论认为ATP荧光检测可以在一定程度上代替细菌常规检测，并应用于实际生产。
参考文献：
[1]
史帅.ATP荧光法快检系统实现细菌总数的快速检测[J].食品安全导刊，2008（3）：51-52.
[2]Thaller M C，Renzini G. Reliability of a bioluminescence ATP assay for detection of becteria [J].Journal of Clinical Microbiology， 1992，30（7）：1739-1742.
ATP荧光检测仪是近年来的新生产物，可以通过荧光值快速反映出细菌菌落数。本研究以金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） 、大肠杆菌（8099）为试材，培养24 h后，各自稀释11个梯度（10倍稀释），并进行细菌计数；同时采用ATP荧光仪对每一个稀释梯度进行荧光检测。以lg（菌落数）为横坐标（x），以ATP荧光值（y）为纵坐标，分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合，发现二者之间关系符合指数曲线，相关系数均接近0.9或以上。以屠宰场的要求“<1 000荧光值为合格，>2 000荧光值为不合格”为实例进行使用指导：当实际lg（菌落数）>10.04时，得出不合格的结论；当实际lg（菌落数）<8.27时，得出合格的结论；但如果8.27<实际lg（菌落数）<10.04时，则容易出现误判。结论认为ATP荧光检测可以在一定程度上代替细菌常规检测，并应用于实际生产。
关键词：ATP荧光检测仪；细菌；常规计数；相关性
中图分类号：Q93-331文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0111-04
AbstractATP fluorescence detector， as a new technical device， can rapidly reflect the amounts of bacterial colonies via fluorescence value. Selecting Staphylococcus aureus ATCC 6538 and Escherichia coli 8099 as materials， the number of colonies were counted after cultured for 24 hours and diluted to 11 gradients （10 times dilution）. Meanwhile， the fluorescence value of each dilution was detected by ATP fluorescence detector. On the basis of these results， with lg（CFU） as abscissa （x） and ATP fluorescence value as ordinate （y）， the linear fitting， logarithm fitting and exponent fitting were conducted；it was found that the relationship between lg（CFU） and ATP fluorescence value was in accordance with exponential curve with the correlation coefficient of close to 0.9 or above. According to the requirement of slaughterhouse， if the fluorescence value was less than 1 000， it is qualified； if fluorescence value was greater than 2 000， it is not qualified. It could be explained as follows. If actual lg（CFU） was greater than 10.04， it should be unqualified； if actual lg （CFU） was less than 8.27， it should be qualified. But when actual lg（CFU） was between 8.27 and 10.04， it should be prone to misjudge. Ultimately， to some extent， the ATP fluorescence detection was able to replace the bacteria conventional detection to be used in actual production.
Key wordsATP fluorescence detector； Bacteria； Conventional count； Correlation
在细菌总数的检测中，传统的培养法由于检测时间较长，已经不能满足食品企业实施HACCP体系时实时监控的要求1。20世纪80年代，英国首先研制出ATP 检测系统，随后发展到欧洲、美国和日本。应用范围涉及食品加工等行业，检测内容包括生物和食品残渣2；快速检测宇宙空间水系统中微生物量也是该技术较早应用的领域之一3；也有将ATP （三磷酸腺苷）生物荧光法引入到医疗机构器械清洗前、后残留物检测4。在我国，基于国家发明专利“含虫光素基因的新型菌株及虫光素酶的生产方法”5的一种荧光检测仪逐步被应用，其能通过ATP荧光仪与Ultrasnap配合使用，采用生物发光技术检测残留的ATP作为表面清洁度的指标。本研究即通过ATP计数与细菌常规检测两种方法互相印证，探索二者之间的相关性，并举例得出几个节点数据指导实践应用。
1材料与方法
1.1试剂与设备
无菌蒸馏水；营养肉汤（NB）；营养琼脂（按GB/T47899.28-2003配制）；试管；培养皿；移液枪；数显气浴恒温震荡器；超净工作台；恒温培养箱；电动混合器；3M ATP荧光检测仪。
1.2试验菌悬液制备
试验菌为金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） 、大肠杆菌（8099） ，购自中国兽医药品监察所。取各冻干菌种管，在无菌操作下，用毛细吸管向其加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取少许滴入含 5.0～10.0 mL 营养肉汤的试管，置37℃培养24 h。每株菌培养2组。每组从原液开始用含1 g/L胰蛋白胨生理盐水进行10倍梯度稀释，直至10-10，共11个稀释浓度。 1.3细菌计数试验
1.3.1常规检测法于超净工作台将冷却至40～45℃的熔化营养琼脂培养基倾注于平皿中，每平皿15～20 mL。每组取11个稀释度菌悬液涂板培养，接种体积为1 mL，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养16～48 h，观察并进行细菌计数。每个稀释度重复3皿。
1.3.2ATP计数仪检测法将棉拭子分别浸入每组11个稀释度菌悬液3～4 s，然后将棉拭子插入检测管，用拇指和中指捏住球管，从吸阀处折断。轻挤球管2次，挤出球管内液体。再将检测管放入发光仪中，盖上盖子，开始检测，根据数显仪判读结果。对所有菌悬液的所有梯度均用ATP荧光计数仪进行检测，并记录数据。
1.4相关性分析
用Microsoft Excel进行相关性分析，以lg（细菌数）为横坐标，以ATP荧光值（RLU）为纵坐标，分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合。
2结果与分析
2.1不同菌落数对应的ATP荧光值
由表1看出，该试验中最少菌落数（32～200个/mL）也能读出荧光值，对应lg（菌落数）为1.51～2.3。而根据仪器公司提供的参考限量标准，最高要求的乳品、果汁等高风险产品加工表面合格菌要求RLU值<150，由此说明该仪器具有较好的灵敏度。同时发现，随着菌落数的降低，RLU值也在降低，二者呈正相关关系。
2.2菌落数与ATP荧光值的不同曲线拟合研究
以lg（菌落数）为横坐标（x），以ATP荧光值（y）为纵坐标，分别进行线性、对数、乘幂、指数拟合，相关系数见表2。因为RLU值与lg（菌落数）呈正相关关系，所以不采用多项式拟合。由表2可见，线性与对数相关系数均在0.8以下，没有统计学意义；乘幂拟合的相关系数较好，但是所有数值均低于指数拟合。大肠杆菌与金黄色葡萄球菌指数相关系数相当，均集中在0.9左右，可见该方法对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌均有效。
3讨论与结论
ATP荧光计数仪还是一个前沿产物，已有部分研究证明其可以在一定程度上代替细菌常规检测6～8。但从数值上看，二者仍然存在一定差异，例如王绍鑫等（2013）9发现，ATP荧光检测总合格率为61.30%，实验室细菌计数法总合格率为83.70%。在数据分析方面，刘俊江等（2013）6认为菌落总数对数值与发光强度对数值呈线性关系，y=0.61032x+0.07459，相关系数R2=0.96073。而本研究发现在4个试验中，菌落数与荧光值线性相关系数很低，而指数相关系数较高，在0.89～0.96之间。深入对比发现，本试验构建的是梯度稀释模型，菌落数跨度从102～1013，而很多研究仅是检测现实样品，其菌落数多数集中在102～105 10。这从侧面证明，菌落数与荧光值线性相关系数仅在一定范围内有效，而扩大到细菌可能的最大浓度发现，二者基本呈指数相关。结论认为ATP荧光检测可以在一定程度上代替细菌常规检测，并应用于实际生产。
参考文献：
[1]
史帅.ATP荧光法快检系统实现细菌总数的快速检测[J].食品安全导刊，2008（3）：51-52.
[2]Thaller M C，Renzini G. Reliability of a bioluminescence ATP assay for detection of becteria [J].Journal of Clinical Microbiology， 1992，30（7）：1739-1742.