【摘 要】
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目的:探讨腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ(hFIX)基因在小鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)中的表达.方法:体外分离培养小鼠脂肪干细胞,观察其细胞形态,CCK-8法测定其
【机 构】
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华北理工大学附属医院血液内科,河北唐山063000
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目的:探讨腺病毒介导的人凝血因子Ⅸ(hFIX)基因在小鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)中的表达.方法:体外分离培养小鼠脂肪干细胞,观察其细胞形态,CCK-8法测定其生长活力,流式细胞术鉴定其细胞表型CD29、CD90、CD45,成脂成骨诱导鉴定其分化能力.将携带hIX基因的腺病毒转染小鼠脂肪干细胞,对比观察其与未转染时细胞形态及生长曲线有无变化.RT-PCR检测hFIX基因在细胞中的表达,Western blot检测细胞内及培养细胞上清液中hFIX蛋白的表达.ELISA法检测细胞上清液中的hFIX蛋白量(The antigen content of hFIX,FIX: Ag),一期法检测培养细胞上清液中hFIX蛋白活性(The clotting factor activity of hFIX,FIX:C).结果:小鼠ADSC离体培养最初几小时呈体积较小的圆球形,具有很强的折光性,贴壁生长时间为种瓶后4-6h,种瓶后72 h细胞变为长梭形纤维状,呈漩涡状排列;第3代ADSC体外培养1-2d生长速度较缓慢,3-5d增殖速度增快,呈指数倍扩增,6-7d生长速度逐渐缓慢,总体生长趋势呈S型;油红O对诱导后细胞进行染色,用倒置显微镜观察,可见红色脂滴形成.茜素红对诱导后细胞进行染色,用倒置相差显微镜观察,可见橙红色钙化骨节.第3代ADSC高表达CD29 (99.91％),CD90(99.02％),几乎不表达CD45 (0.94％).RT-PCR结果显示,hFIX基因可以在小鼠脂肪干细胞内表达.Western blot结果显示,小鼠脂肪干细胞内及培养细胞上清液中均可表达hFIX蛋白.ELISA测定转染ADSC培养上清FIX:Ag:第1d为21.33±3.93 ng/(106 cells·24 h),第3d为12.63±0.86 ng/(106cells·24 h),第9d为12.63±2.36 ng/(106 cells·24 h).一期法检测培养细胞上清液中FIX:C为8.5％.结论:携带hFIX基因的腺病毒能有效转染ADSC.hFIX基因修饰的ADSC可以分泌具有凝血活性的hFIX蛋白.
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