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摘要：以‘国光’及其芽变材料为试材， 利用AFLP技术采用4对引物对其进行初步鉴定，并对果实品质和果皮色泽进行对比分析。结果表明：‘国光’芽变材料在平均单果重、果实大小、可溶性固性物含量、果皮着色指数方面，均极显著优于母株;4对引物组合共扩增出283条条带，多态性条带65条，多态性条带比率为3736%，差异化片段大部分集中在100～400 bp，其中引物E75/M54多态性比率最高，达71.79%，具有较高的应用价值。
关键词：苹果;AFLP;芽变;鉴定
中图分类号：S661.103.7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）10-0021-04
Fruit Quality and AFLP Analysis of Ralls and Its Bud Mutation
Nie Peixian1， Yu Shuzeng2， Chen Langbo3， Xue Xiaomin1， Wang Jinzheng1
（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China; 2.Wendeng Agricultural Bureau in Weihai， Weihai 264400， China;
3.Weihai Fruit Tree and Tea Workstation， Weihai 264200， China）
Abstract AFLP was used to identify Ralls and its bud mutation with 4 pairs of primers. Their fruit quality and pericarp colour were also compared. The results showed that the mutation was very significantly better than Ralls in average single fruit weight， fruit size， soluble solid content and pericarp coloring index. A total of 288 bands were amplified with the 4 pairs of primer combinations， in which， there were 65 polimophic bands with the polymorphism ratio as 37.36%. Most of the different fragments were concentrated in 100～400 bp. The polymorphism ratio was the highest with the primer combination E75/M54， reaching 71.79%， with high application value.
Keywords Apple; AFLP; Bud mutation; Identification
芽變是体细胞变异的一种，也是果树育种的重要材料来源，在果树育种中起重要作用[1]。苹果是遗传背景高度杂合的多年生木本植物，芽变频率高，因此芽变选种在其育种中占有十分重要的地位[2]。为了排除外在环境条件所引起的彷徨变异或者饰变，需要对芽变材料进行鉴定。目前，芽变鉴定方法已发展到分子水平，并在多种作物的遗传鉴定分析中得以应用 [3-6]，所用分子技术主要包括RAPD、AFLP、RFLP、ISSR、DNA甲基化等。与传统品种鉴定方法相比，DNA分子标记不受芽变材料生长时期、环境以及所取部位的影响，具有检测结果可靠、耗时短、多态性高等优点。
本研究以2001年10月在山东省威海市文登区泽头镇大宋家村发现的1株‘国光’芽变材料为试材，以该地园区内‘国光’为对照，利用AFLP技术从分子水平上比对两者的遗传差异，并对果实品质和果皮色泽进行对比分析，旨在为苹果芽变的鉴定提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选择嫁接到红富士植株上多年的‘国光’芽变材料以及同一园区种植的芽变母株（CK）为试材，2017年10月中旬采果，部分样品液氮速冻后，-80℃保存备用。
1.2 主要试剂
限制性内切酶EcoRⅠ/MseⅠ和T4 DNA连接酶购自NEB公司;选择性扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.3 试验方法
1.3.1 果实品质指标测定参照文献[7]的方法测定果实相关品质指标。果实成熟后，分别选取30个果实，用精度0.1 g的天平称量单果重;数字显示游标卡尺测定果实纵径和横径，计算果形指数;TD-45 型数字折光仪测定可溶性固形物含量;GY-1 型果实硬度计测定果实硬度。
1.3.2 果实着色指标测定根据果实着色面积确定着色等级，并计算着色指数。用Konica Minolta CR410型色彩色差计测定果皮的L值、a值和b值，并计算c值和H值，c=√（a2+b2），H=arctan（b/a）[8]。其中，L值表示果面亮度，0为黑色，100为白色;a值表示果皮的红绿色度，正值偏红，负值偏绿，绝对值越大则表示红色或者绿色越深;b值表示果皮的橙蓝色度，正值偏橙，负值偏蓝，绝对值越大则表示橙色或者蓝色越深;c值表示果皮颜色的彩度，值越大颜色越纯;H反映果皮红橙黄绿蓝及其过渡色的变化，变化范围在0°～180°，当H<50°时，值越小表示红色越深，当H>100°时，值越大表示绿色越深，0°为紫红色、90°为黄色、180°为绿色。 1.3.3 AFLP分子标记参照李元军等[2]的方法进行AFLP分析并稍作改动。DNA的提取采用改良CTAB法;使用EcoRⅠ/MseⅠ对DNA进行双酶切，T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接;利用表1中的引物进行预扩增（引物E0/M0）和选择性扩增（引物分别为E45/M65、E75/M54、E86/M64、E86/M85）;6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产物，银染后拍照并记录。
1.4 数据统计与分析
利用Microsoft Excel软件进行数据整理，SPSS 18.0软件进行差异分析。
AFLP分析中某一条扩增条带出现时记为“1”，不存在记为“0”。遗传相似系数（GS）采用Nei 和Li[9]的方法计算，GS=2Nij/（Ni+Nj）;多态性比率=（Ni+Nj-2Nij）/（Ni+Nj-Nij）×100%，Nij表示样本i和j的共同条带数，Ni、Nj分别为样本i、j的条带数。
2 结果与分析
2.1 果实品质的比较
由表2可以看出，与CK相比，芽变材料的平均单果重、果实纵径和横径、可溶性固形物含量极显著增加，分别提高16.27%、5.61%、6.74%、15.85%;果实硬度极显著下降，降幅為5.00%;果形指数没有明显变化。
2.2 果实着色的比较分析
果品的色泽指标是决定果实外观品质的重要因素之一。由表3可知，芽变材料和CK 的L值均大于50，但CK的果面亮度极显著高于芽变材料，两者表面亮度均偏亮。a值和H值均可表示果皮表面颜色在红绿方向上的变化，芽变材料果皮色差a值偏大H值偏小，说明芽变材料果皮偏向红色，这与肉眼观察到的果实着色指数表现一致，且与CK相比，H值的差异达到极显著水平。芽变材料b值、c值均显著低于CK，说明CK较芽变材料果皮偏橙色，色彩较纯。芽变材料的着色指数极显著高于CK，着色面积较均匀。
2.3 可溶性固形物和果皮色差各指标间的相关性分析
本试验相关系数r标准为：0≤|r|<0.4为低度相关、0.4≤|r|<0.7为中度相关、0.7≤|r|<1为高度相关。芽变材料和CK的可溶性固形物含量与果皮色差各指标相关性分析结果（表4）显示，两者表现出较大差异，芽变材料可溶性固形物含量与L值、b值和H值均表现为中度负相关，与a值、c值呈中度正相关;CK可溶性固形物含量与果皮色差各项指标相关不明显。
2.4 果皮色差各指标间的相关性分析
由表4可以看出，芽变材料果皮色差的L值与a值、c值呈中度负相关，与b值、H值呈高度正相关;CK 果皮色差的L值与a值、c值呈高度负相关，与b值、H值呈高度正相关，均达到极显著水平。
2.5 扩增引物的筛选及分子多态性分析
以‘国光’和其芽变材料DNA为模板，通过4对AFLP引物组合的PCR扩增，结果（表5）显示，4对引物组合共扩增出283条清晰可辨的条带，对照和芽变材料分别为130条和153条，共有条带109条，多态性条带65条。计算得遗传相似系数为77.03%，多态性条带比率为37.36%，差异化片段大部分集中在100～400 bp。
由图1可知，每对引物均能在不同材料中扩增出多个差异位点。E75/M54引物组合多态性比率最高，为71.79%;E86/M85引物组合次之，为63.63%;E86/M64和E45/M65引物组合多态性比率较低，分别为30.23%和5.08%。上述结果在一定程度上反映了芽变材料和‘国光’中遗传物质的变异频率，证实两者在DNA分子水平上发生变化。
3 讨论与结论
苹果发生芽变后，会表现出芽变的多效性。与母株相比，芽变材料在植株形态、果个大小、果皮色泽等方面发生一定程度变异。本研究中的‘国光’芽变材料在平均单果重、果实大小、可溶性固性物含量和果面着色指数均极显著高于对照;使用AFLP分子标记方法发现了芽变材料与对照间的差异片段，表明‘国光’芽变材料确实发生了遗传物质的改变。
通常在AFLP分析中，每一条扩增条带对应着DNA分子上的一个位点，不同引物扩增带的带型、数量和分布均匀程度有着比较大的差异，区分能力也不同[10]。如AFLP对苹果砧木基因型分析中，P32/M64引物扩增效率高，图谱质量好，条带清晰[11];对柑橘的遗传分析中，发现9对引物多态性高，分辨能力强[12]。本试验也发现相似情况， 4对引物在芽变材料和母株中共扩增出283条条带，出现65条多态性条带，即检测到283个扩增位点，65个多态性位点，多态性条带比率达到37.36%。引物组合E75/M54多态性比率高达71.79%，而E45/M65仅有5.08%。由此可见，引物组合E75/M54在‘国光’品种芽变材料的区分上分辨率高、多态性强，对标记‘国光’苹果农艺性状具有较高的应用价值。
参 考 文 献：
[1]伊凯， 闫忠业， 刘志， 等. 苹果芽变选种鉴定及应用研究[J]. 果树学报， 2006， 23（5）：745-749.
[2]李元军，唐美玲，于青，等. 富士苹果AFLP体系的优化及其在鉴定早熟芽变中的应用[J]. 园艺学报， 2009， 36（3）：327-332.
[3]孙淑霞， 陈栋， 李靖， 等. 北京28号桃芽变株系的ISSR和SSR鉴定[J]. 果树学报， 2012， 29（1）：24-28.
[4]许淼， 蒋迎春， 孙中海， 等. 鄂柑一号椪柑少核芽变的AFLP分析[J]. 湖北农业科学， 2011， 50（17）：3556-3559.
[5]赵卫国， 汪伟， 潘一乐. 凤尾桑及其芽变品系间遗传变异的ISSR分析[J]. 蚕桑通报， 2006（3）：27-29.
[6]于祎飞， 杨素描， 刘俊， 等. ‘国光’苹果芽变新品种‘红光2号’的选育[J]. 果树学报， 2016， 33（4）：492-495.
[7]聂佩显， 王金政， 路超， 等. 不同时期疏花疏果对红富士苹果花序坐果率和果实品质的影响[J]. 山东农业科学， 2013， 45（12）：27-29.
[8]李桂祥， 马瑞娟， 张斌斌， 等. 套袋对霞晖6号桃果实发育过程中果皮色素含量和色差的影响[J]. 江苏农业学报， 2012， 28（6）：1418-1423.
[9]Nei M， Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1979， 76（10）：5269-5273.
[10]祝军，王涛，赵玉军， 等. 应用AFLP分子标记鉴定苹果品种[J]. 园艺学报， 2000， 27（2）：102-106.
[11]祝军， 王涛， 李光晨， 等. 苹果AFLP分析体系的建立[J]. 中国农业大学学报， 2000， 5（3）：63-67.
[12]王平， 唐小浪， 马培恰， 等. 辐射诱变和芽变柑橘品种（系）的AFLP分析[J]. 果树学报， 2012， 29（1）：130-134.
收稿日期：2019-05-27
基金项目：山东省重点研发计划项目（2017CXGC0210）;国家现代农业产业技术体系建设项目（CARS-28）
作者简介：聂佩显（1982—），男，山东潍坊人，助理研究员，研究方向：苹果栽培生理及果实品质调控。E-mail：nieguan2008@163.com
通讯作者：王金政（1959—），男，山东潍坊人，研究员，研究方向：果树遗传育种与设施栽培。E-mail： wjz992001@163.com
关键词：苹果;AFLP;芽变;鉴定
中图分类号：S661.103.7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）10-0021-04
Fruit Quality and AFLP Analysis of Ralls and Its Bud Mutation
Nie Peixian1， Yu Shuzeng2， Chen Langbo3， Xue Xiaomin1， Wang Jinzheng1
（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China; 2.Wendeng Agricultural Bureau in Weihai， Weihai 264400， China;
3.Weihai Fruit Tree and Tea Workstation， Weihai 264200， China）
Abstract AFLP was used to identify Ralls and its bud mutation with 4 pairs of primers. Their fruit quality and pericarp colour were also compared. The results showed that the mutation was very significantly better than Ralls in average single fruit weight， fruit size， soluble solid content and pericarp coloring index. A total of 288 bands were amplified with the 4 pairs of primer combinations， in which， there were 65 polimophic bands with the polymorphism ratio as 37.36%. Most of the different fragments were concentrated in 100～400 bp. The polymorphism ratio was the highest with the primer combination E75/M54， reaching 71.79%， with high application value.
Keywords Apple; AFLP; Bud mutation; Identification
芽變是体细胞变异的一种，也是果树育种的重要材料来源，在果树育种中起重要作用[1]。苹果是遗传背景高度杂合的多年生木本植物，芽变频率高，因此芽变选种在其育种中占有十分重要的地位[2]。为了排除外在环境条件所引起的彷徨变异或者饰变，需要对芽变材料进行鉴定。目前，芽变鉴定方法已发展到分子水平，并在多种作物的遗传鉴定分析中得以应用 [3-6]，所用分子技术主要包括RAPD、AFLP、RFLP、ISSR、DNA甲基化等。与传统品种鉴定方法相比，DNA分子标记不受芽变材料生长时期、环境以及所取部位的影响，具有检测结果可靠、耗时短、多态性高等优点。
本研究以2001年10月在山东省威海市文登区泽头镇大宋家村发现的1株‘国光’芽变材料为试材，以该地园区内‘国光’为对照，利用AFLP技术从分子水平上比对两者的遗传差异，并对果实品质和果皮色泽进行对比分析，旨在为苹果芽变的鉴定提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选择嫁接到红富士植株上多年的‘国光’芽变材料以及同一园区种植的芽变母株（CK）为试材，2017年10月中旬采果，部分样品液氮速冻后，-80℃保存备用。
1.2 主要试剂
限制性内切酶EcoRⅠ/MseⅠ和T4 DNA连接酶购自NEB公司;选择性扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.3 试验方法
1.3.1 果实品质指标测定参照文献[7]的方法测定果实相关品质指标。果实成熟后，分别选取30个果实，用精度0.1 g的天平称量单果重;数字显示游标卡尺测定果实纵径和横径，计算果形指数;TD-45 型数字折光仪测定可溶性固形物含量;GY-1 型果实硬度计测定果实硬度。
1.3.2 果实着色指标测定根据果实着色面积确定着色等级，并计算着色指数。用Konica Minolta CR410型色彩色差计测定果皮的L值、a值和b值，并计算c值和H值，c=√（a2+b2），H=arctan（b/a）[8]。其中，L值表示果面亮度，0为黑色，100为白色;a值表示果皮的红绿色度，正值偏红，负值偏绿，绝对值越大则表示红色或者绿色越深;b值表示果皮的橙蓝色度，正值偏橙，负值偏蓝，绝对值越大则表示橙色或者蓝色越深;c值表示果皮颜色的彩度，值越大颜色越纯;H反映果皮红橙黄绿蓝及其过渡色的变化，变化范围在0°～180°，当H<50°时，值越小表示红色越深，当H>100°时，值越大表示绿色越深，0°为紫红色、90°为黄色、180°为绿色。 1.3.3 AFLP分子标记参照李元军等[2]的方法进行AFLP分析并稍作改动。DNA的提取采用改良CTAB法;使用EcoRⅠ/MseⅠ对DNA进行双酶切，T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接;利用表1中的引物进行预扩增（引物E0/M0）和选择性扩增（引物分别为E45/M65、E75/M54、E86/M64、E86/M85）;6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产物，银染后拍照并记录。
1.4 数据统计与分析
利用Microsoft Excel软件进行数据整理，SPSS 18.0软件进行差异分析。
AFLP分析中某一条扩增条带出现时记为“1”，不存在记为“0”。遗传相似系数（GS）采用Nei 和Li[9]的方法计算，GS=2Nij/（Ni+Nj）;多态性比率=（Ni+Nj-2Nij）/（Ni+Nj-Nij）×100%，Nij表示样本i和j的共同条带数，Ni、Nj分别为样本i、j的条带数。
2 结果与分析
2.1 果实品质的比较
由表2可以看出，与CK相比，芽变材料的平均单果重、果实纵径和横径、可溶性固形物含量极显著增加，分别提高16.27%、5.61%、6.74%、15.85%;果实硬度极显著下降，降幅為5.00%;果形指数没有明显变化。
2.2 果实着色的比较分析
果品的色泽指标是决定果实外观品质的重要因素之一。由表3可知，芽变材料和CK 的L值均大于50，但CK的果面亮度极显著高于芽变材料，两者表面亮度均偏亮。a值和H值均可表示果皮表面颜色在红绿方向上的变化，芽变材料果皮色差a值偏大H值偏小，说明芽变材料果皮偏向红色，这与肉眼观察到的果实着色指数表现一致，且与CK相比，H值的差异达到极显著水平。芽变材料b值、c值均显著低于CK，说明CK较芽变材料果皮偏橙色，色彩较纯。芽变材料的着色指数极显著高于CK，着色面积较均匀。
2.3 可溶性固形物和果皮色差各指标间的相关性分析
本试验相关系数r标准为：0≤|r|<0.4为低度相关、0.4≤|r|<0.7为中度相关、0.7≤|r|<1为高度相关。芽变材料和CK的可溶性固形物含量与果皮色差各指标相关性分析结果（表4）显示，两者表现出较大差异，芽变材料可溶性固形物含量与L值、b值和H值均表现为中度负相关，与a值、c值呈中度正相关;CK可溶性固形物含量与果皮色差各项指标相关不明显。
2.4 果皮色差各指标间的相关性分析
由表4可以看出，芽变材料果皮色差的L值与a值、c值呈中度负相关，与b值、H值呈高度正相关;CK 果皮色差的L值与a值、c值呈高度负相关，与b值、H值呈高度正相关，均达到极显著水平。
2.5 扩增引物的筛选及分子多态性分析
以‘国光’和其芽变材料DNA为模板，通过4对AFLP引物组合的PCR扩增，结果（表5）显示，4对引物组合共扩增出283条清晰可辨的条带，对照和芽变材料分别为130条和153条，共有条带109条，多态性条带65条。计算得遗传相似系数为77.03%，多态性条带比率为37.36%，差异化片段大部分集中在100～400 bp。
由图1可知，每对引物均能在不同材料中扩增出多个差异位点。E75/M54引物组合多态性比率最高，为71.79%;E86/M85引物组合次之，为63.63%;E86/M64和E45/M65引物组合多态性比率较低，分别为30.23%和5.08%。上述结果在一定程度上反映了芽变材料和‘国光’中遗传物质的变异频率，证实两者在DNA分子水平上发生变化。
3 讨论与结论
苹果发生芽变后，会表现出芽变的多效性。与母株相比，芽变材料在植株形态、果个大小、果皮色泽等方面发生一定程度变异。本研究中的‘国光’芽变材料在平均单果重、果实大小、可溶性固性物含量和果面着色指数均极显著高于对照;使用AFLP分子标记方法发现了芽变材料与对照间的差异片段，表明‘国光’芽变材料确实发生了遗传物质的改变。
通常在AFLP分析中，每一条扩增条带对应着DNA分子上的一个位点，不同引物扩增带的带型、数量和分布均匀程度有着比较大的差异，区分能力也不同[10]。如AFLP对苹果砧木基因型分析中，P32/M64引物扩增效率高，图谱质量好，条带清晰[11];对柑橘的遗传分析中，发现9对引物多态性高，分辨能力强[12]。本试验也发现相似情况， 4对引物在芽变材料和母株中共扩增出283条条带，出现65条多态性条带，即检测到283个扩增位点，65个多态性位点，多态性条带比率达到37.36%。引物组合E75/M54多态性比率高达71.79%，而E45/M65仅有5.08%。由此可见，引物组合E75/M54在‘国光’品种芽变材料的区分上分辨率高、多态性强，对标记‘国光’苹果农艺性状具有较高的应用价值。
参 考 文 献：
[1]伊凯， 闫忠业， 刘志， 等. 苹果芽变选种鉴定及应用研究[J]. 果树学报， 2006， 23（5）：745-749.
[2]李元军，唐美玲，于青，等. 富士苹果AFLP体系的优化及其在鉴定早熟芽变中的应用[J]. 园艺学报， 2009， 36（3）：327-332.
[3]孙淑霞， 陈栋， 李靖， 等. 北京28号桃芽变株系的ISSR和SSR鉴定[J]. 果树学报， 2012， 29（1）：24-28.
[4]许淼， 蒋迎春， 孙中海， 等. 鄂柑一号椪柑少核芽变的AFLP分析[J]. 湖北农业科学， 2011， 50（17）：3556-3559.
[5]赵卫国， 汪伟， 潘一乐. 凤尾桑及其芽变品系间遗传变异的ISSR分析[J]. 蚕桑通报， 2006（3）：27-29.
[6]于祎飞， 杨素描， 刘俊， 等. ‘国光’苹果芽变新品种‘红光2号’的选育[J]. 果树学报， 2016， 33（4）：492-495.
[7]聂佩显， 王金政， 路超， 等. 不同时期疏花疏果对红富士苹果花序坐果率和果实品质的影响[J]. 山东农业科学， 2013， 45（12）：27-29.
[8]李桂祥， 马瑞娟， 张斌斌， 等. 套袋对霞晖6号桃果实发育过程中果皮色素含量和色差的影响[J]. 江苏农业学报， 2012， 28（6）：1418-1423.
[9]Nei M， Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1979， 76（10）：5269-5273.
[10]祝军，王涛，赵玉军， 等. 应用AFLP分子标记鉴定苹果品种[J]. 园艺学报， 2000， 27（2）：102-106.
[11]祝军， 王涛， 李光晨， 等. 苹果AFLP分析体系的建立[J]. 中国农业大学学报， 2000， 5（3）：63-67.
[12]王平， 唐小浪， 马培恰， 等. 辐射诱变和芽变柑橘品种（系）的AFLP分析[J]. 果树学报， 2012， 29（1）：130-134.
收稿日期：2019-05-27
基金项目：山东省重点研发计划项目（2017CXGC0210）;国家现代农业产业技术体系建设项目（CARS-28）
作者简介：聂佩显（1982—），男，山东潍坊人，助理研究员，研究方向：苹果栽培生理及果实品质调控。E-mail：nieguan2008@163.com
通讯作者：王金政（1959—），男，山东潍坊人，研究员，研究方向：果树遗传育种与设施栽培。E-mail： wjz992001@163.com