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摘 要：通过单因素实验和正交实验，对胧月黄酮类化合物的最佳提取工艺进行了设计优化。在料液比为1∶25、乙醇体积分数为60%、超声波功率为70 W、超声时间为40 min、超声温度为40 ℃的提取工艺条件下，黄酮类化合物的得率为1.851%。
关键词：胧月;黄酮类化合物;提取
胧月为景天科风车草，属多肉植物，原产于墨西哥，有耐寒、抗旱、对高低温及温差适应性强等特点，一般应用于特殊生态环境的立体绿化[1]。胧月中富含各种黄酮类化合物，具有非常重要的抗氧化和杀菌效果，但目前关于胧月开发应用的研究较少。
黄酮类化合物泛指由中央三碳连接两个具有酚羟基苯环的一系列化合物[2]，有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老等药理活性[3]。黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是通过植物的光合作用生成的常见的天然有机化合物，景天三七、红景天等药材提取物中都有黄酮类化合物[4-5]。
近年来，超声波提取黄酮类化合物的工艺应用越来越广泛。实践证明，超声波提取工艺能有效提高细胞破碎率，有利于析出有效成分，且操作简单，物料损失小，提取率相对较高[6]。本实验利用超声波提取工艺，通过单因素实验和正交实验，对胧月黄酮类化合物的最佳提取工艺进行了设计优化，为胧月的后续开发应用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），T6新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），高功率数控超声波清洗器（KQ-100KDE型，昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 实验试剂
胧月样品：取新鲜的胧月叶瓣，60 ℃恒温干燥36 h，研磨成细粉，置于干燥箱中继续烘干至恒重，放于干燥皿中备用。
芦丁：规格98%，分子式C27H30O16，北京百灵威科技有限公司生产。
1.3 实验方法
1.3.1 芦丁标准曲线的绘制
准确制备1 mg/mL芦丁标准溶液，分别移取0、2、4、6、8、10 mL芦丁标准溶液置于容量瓶中，分次加入5%亚硝酸钠溶液1.4 mL、10%硝酸铝溶液1.4 mL，混匀放置6 min，最后加入4%氢氧化钠溶液10 mL，摇匀后用体积分数为60%的乙醇定容至50 mL，混匀放置15 min。在510 nm波长处测定芦丁标准系列溶液的吸光值。
设芦丁的质量浓度为x，测得的紫外吸收值为y，建立线性回归方程。结果表明，在0～0.2 mg/mL，线性回归方程为：
y=11.024 x+0.003 2（R2=0.999 8）（1）
1.3.2 胧月总黄酮的提取测定
准确称取0.500 0 g胧月样品干粉于50 mL烧杯中，按照一定料液比加入特定体积分数的乙醇溶液，用保鲜膜封口，放在数控超声仪中，设置超声温度、超声时间、超声功率等参数，进行超声。超声结束后，真空抽滤两次，即得胧月总黄酮提取液。
将胧月总黄酮提取液移至50 mL容量瓶中，在510 nm处用紫外-可见分光光度计测量吸光值。
用线性回归方程計算胧月提取液中的黄酮质量分数，从而计算出胧月干粉中黄酮的质量分数，计算公式为：
式中，T为胧月样品干粉的黄酮质量分数，mg/g;Q为胧月提取液的黄酮质量浓度，mg/mL;V为容量瓶体积，mL;m为胧月样品的干粉质量，g。
平行实验3次，取平均值。
1.3.3 单因素实验
准确称取0.500 0 g胧月样品干粉，以胧月黄酮得率为衡量标准，分别探讨料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、超声温度（30、40、50、60、 70 ℃）、超声功率（40、50、60、70、80 W）等因素对胧月黄酮得率的影响，每种因素做3次平行实验，从而确定各因素的最佳水平区间。
1.3.4 正交实验
根据单因素实验得到的结果，以胧月黄酮得率为标准，设计3因素3水平的正交实验，确定最佳提取条件。正交实验因素水平如表1所示。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验结果分析
2.1.1 料液比对黄酮得率的影响
不同的料液比对胧月中黄酮得率的影响如图1所示。从图1中可以看出，当提取剂乙醇的体积增加时，胧月样品中的黄酮得率逐步升高;当料液比为1∶10～1∶20时，黄酮得率的增幅较大;料液比为1∶25时，胧月黄酮得率最高，为1.36%，之后开始略微下降。结果表明，在一定范围内，料液比越大，胧月样品中黄酮类化合物的溶出越彻底。但是过高的料液比也会促进样品中非黄酮类杂质的溶出，影响黄酮的得率。因此，料液比最好为1∶25。
2.1.2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响
乙醇体积分数对黄酮得率的影响如图2所示。从图2中可以看出，随着乙醇体积分数的提高，胧月中的黄酮得率先提高后降低，当乙醇体积分数达到60%时，胧月中的黄酮得率达到最大值，为1.20%。随着乙醇体积分数的持续提升，胧月中黄酮的得率逐渐下降。有可能是因为乙醇体积分数的提升，促进了非黄酮类杂质化合物的溶出，影响了黄酮的得率。因此，乙醇的体积分数应该控制在60%左右。
2.1.3 超声提取时间对黄酮得率的影响
超声提取时间对黄酮得率的影响如图3所示。从图3中可以看出，随着超声提取时间的延长，胧月中黄酮的得率略有增加，但是增幅不大，在超声时间为40 min时，达到最大值，为0.67%。在长时间的超声波提取过程中，溶液中的局部温度会异常升高，影响胧月中黄酮的得率，因此将胧月中黄酮的提取时间确定为40 min。 2.1.4 超声提取温度对黄酮得率的影响
超声提取温度对黄酮得率的影响如图4所示。由图4可知，胧月中黄酮的得率随温度变化而变化，在40 ℃时达到最高值，为1.48%，但在温度超过40 ℃后，黄酮得率反而下降，因此选择超声温度为40 ℃左右比较合适。当温度升高时，细胞中的大分子扩散速度加快，溶质扩散速度加快。胧月中的醇溶性杂质随着温度的升高，溶出速度也加快了，并不利于胧月中黄酮的溶出提取。此外，温度升高也会对胧月中的黄酮类化合物分子结构造成破坏，降低提取质量和提取效率。因此，提取温度定为40 ℃。
2.1.5 超声提取功率对黄酮得率的影响
超声提取功率对黄酮得率的影响如图5所示。由图5可知，随着超声功率的提高，胧月中黄酮的得率呈上升趋势。当超声功率为70 W时，胧月中黄酮的得率达到最高值，为0.67%。过高的超声功率也会破坏胧月的细胞壁，导致更多的非黄酮类杂质溶出，不利于胧月中黄酮的提取。所以，超声功率定为70 W。
2.2 正交实验结果分析
正交实验安排及结果如表2所示。由表2可知，当乙醇体积分数为60%、超声温度为40 ℃、料液比为1∶25时，胧月样品中黄酮的得率达到最高值，在该最优组合条件下对样品进行多次平行提取，胧月黄酮得率最高为1.851%。极差大小比较显示，影响因素由强到弱依次为乙醇体积分数、料液比、超声提取温度。
3 结语
以景天科朧月多肉植物为原料，利用超声波辅助提取法提取胧月中的黄酮。通过单因素实验和正交实验得到最佳提取工艺条件。结果表明，当提取工艺条件为：料液比为1∶25、乙醇体积分数为60%、超声时间为40 min、超声温度为40 ℃、超声功率为70 W时，总黄酮最高得率为1.851%。
[参考文献]
[1]宋正达，朱洪武，陈梅香.景天科多肉胧月在立体绿化中的应用研究[J].绿色科技，2015（3）：90-91.
[2]刘一杰，薛永常.植物黄酮类化合物的研究进展[J].中国生物工程杂志，2016，36（9）：81-86.
[3]李萌茹，周玉枝，杜冠华，等.中药黄酮类化合物抗衰老作用及其机制研究进展[J].药学学报，2019，54（8）：1382-1391.
[4]付煜荣，姚荣章.景天三七中总黄酮提取条件和含量分析[J].河北北方学院学报（医学版），2010，27（1）：13-15.
[5]李珊，雷富平.红景天黄酮类化合物提取及药理活性研究进展[J].饮料工业，2016，19（6）：57-59.
[6]田淑雨，鹿士峰，吴杨洋，等.超声破碎辅助提取灵芝多糖工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2019，40（8）：101-107.
关键词：胧月;黄酮类化合物;提取
胧月为景天科风车草，属多肉植物，原产于墨西哥，有耐寒、抗旱、对高低温及温差适应性强等特点，一般应用于特殊生态环境的立体绿化[1]。胧月中富含各种黄酮类化合物，具有非常重要的抗氧化和杀菌效果，但目前关于胧月开发应用的研究较少。
黄酮类化合物泛指由中央三碳连接两个具有酚羟基苯环的一系列化合物[2]，有抗菌消炎、抗氧化、抗衰老等药理活性[3]。黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是通过植物的光合作用生成的常见的天然有机化合物，景天三七、红景天等药材提取物中都有黄酮类化合物[4-5]。
近年来，超声波提取黄酮类化合物的工艺应用越来越广泛。实践证明，超声波提取工艺能有效提高细胞破碎率，有利于析出有效成分，且操作简单，物料损失小，提取率相对较高[6]。本实验利用超声波提取工艺，通过单因素实验和正交实验，对胧月黄酮类化合物的最佳提取工艺进行了设计优化，为胧月的后续开发应用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），T6新世纪紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），高功率数控超声波清洗器（KQ-100KDE型，昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 实验试剂
胧月样品：取新鲜的胧月叶瓣，60 ℃恒温干燥36 h，研磨成细粉，置于干燥箱中继续烘干至恒重，放于干燥皿中备用。
芦丁：规格98%，分子式C27H30O16，北京百灵威科技有限公司生产。
1.3 实验方法
1.3.1 芦丁标准曲线的绘制
准确制备1 mg/mL芦丁标准溶液，分别移取0、2、4、6、8、10 mL芦丁标准溶液置于容量瓶中，分次加入5%亚硝酸钠溶液1.4 mL、10%硝酸铝溶液1.4 mL，混匀放置6 min，最后加入4%氢氧化钠溶液10 mL，摇匀后用体积分数为60%的乙醇定容至50 mL，混匀放置15 min。在510 nm波长处测定芦丁标准系列溶液的吸光值。
设芦丁的质量浓度为x，测得的紫外吸收值为y，建立线性回归方程。结果表明，在0～0.2 mg/mL，线性回归方程为：
y=11.024 x+0.003 2（R2=0.999 8）（1）
1.3.2 胧月总黄酮的提取测定
准确称取0.500 0 g胧月样品干粉于50 mL烧杯中，按照一定料液比加入特定体积分数的乙醇溶液，用保鲜膜封口，放在数控超声仪中，设置超声温度、超声时间、超声功率等参数，进行超声。超声结束后，真空抽滤两次，即得胧月总黄酮提取液。
将胧月总黄酮提取液移至50 mL容量瓶中，在510 nm处用紫外-可见分光光度计测量吸光值。
用线性回归方程計算胧月提取液中的黄酮质量分数，从而计算出胧月干粉中黄酮的质量分数，计算公式为：
式中，T为胧月样品干粉的黄酮质量分数，mg/g;Q为胧月提取液的黄酮质量浓度，mg/mL;V为容量瓶体积，mL;m为胧月样品的干粉质量，g。
平行实验3次，取平均值。
1.3.3 单因素实验
准确称取0.500 0 g胧月样品干粉，以胧月黄酮得率为衡量标准，分别探讨料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、超声时间（10、20、30、40、50 min）、超声温度（30、40、50、60、 70 ℃）、超声功率（40、50、60、70、80 W）等因素对胧月黄酮得率的影响，每种因素做3次平行实验，从而确定各因素的最佳水平区间。
1.3.4 正交实验
根据单因素实验得到的结果，以胧月黄酮得率为标准，设计3因素3水平的正交实验，确定最佳提取条件。正交实验因素水平如表1所示。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验结果分析
2.1.1 料液比对黄酮得率的影响
不同的料液比对胧月中黄酮得率的影响如图1所示。从图1中可以看出，当提取剂乙醇的体积增加时，胧月样品中的黄酮得率逐步升高;当料液比为1∶10～1∶20时，黄酮得率的增幅较大;料液比为1∶25时，胧月黄酮得率最高，为1.36%，之后开始略微下降。结果表明，在一定范围内，料液比越大，胧月样品中黄酮类化合物的溶出越彻底。但是过高的料液比也会促进样品中非黄酮类杂质的溶出，影响黄酮的得率。因此，料液比最好为1∶25。
2.1.2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响
乙醇体积分数对黄酮得率的影响如图2所示。从图2中可以看出，随着乙醇体积分数的提高，胧月中的黄酮得率先提高后降低，当乙醇体积分数达到60%时，胧月中的黄酮得率达到最大值，为1.20%。随着乙醇体积分数的持续提升，胧月中黄酮的得率逐渐下降。有可能是因为乙醇体积分数的提升，促进了非黄酮类杂质化合物的溶出，影响了黄酮的得率。因此，乙醇的体积分数应该控制在60%左右。
2.1.3 超声提取时间对黄酮得率的影响
超声提取时间对黄酮得率的影响如图3所示。从图3中可以看出，随着超声提取时间的延长，胧月中黄酮的得率略有增加，但是增幅不大，在超声时间为40 min时，达到最大值，为0.67%。在长时间的超声波提取过程中，溶液中的局部温度会异常升高，影响胧月中黄酮的得率，因此将胧月中黄酮的提取时间确定为40 min。 2.1.4 超声提取温度对黄酮得率的影响
超声提取温度对黄酮得率的影响如图4所示。由图4可知，胧月中黄酮的得率随温度变化而变化，在40 ℃时达到最高值，为1.48%，但在温度超过40 ℃后，黄酮得率反而下降，因此选择超声温度为40 ℃左右比较合适。当温度升高时，细胞中的大分子扩散速度加快，溶质扩散速度加快。胧月中的醇溶性杂质随着温度的升高，溶出速度也加快了，并不利于胧月中黄酮的溶出提取。此外，温度升高也会对胧月中的黄酮类化合物分子结构造成破坏，降低提取质量和提取效率。因此，提取温度定为40 ℃。
2.1.5 超声提取功率对黄酮得率的影响
超声提取功率对黄酮得率的影响如图5所示。由图5可知，随着超声功率的提高，胧月中黄酮的得率呈上升趋势。当超声功率为70 W时，胧月中黄酮的得率达到最高值，为0.67%。过高的超声功率也会破坏胧月的细胞壁，导致更多的非黄酮类杂质溶出，不利于胧月中黄酮的提取。所以，超声功率定为70 W。
2.2 正交实验结果分析
正交实验安排及结果如表2所示。由表2可知，当乙醇体积分数为60%、超声温度为40 ℃、料液比为1∶25时，胧月样品中黄酮的得率达到最高值，在该最优组合条件下对样品进行多次平行提取，胧月黄酮得率最高为1.851%。极差大小比较显示，影响因素由强到弱依次为乙醇体积分数、料液比、超声提取温度。
3 结语
以景天科朧月多肉植物为原料，利用超声波辅助提取法提取胧月中的黄酮。通过单因素实验和正交实验得到最佳提取工艺条件。结果表明，当提取工艺条件为：料液比为1∶25、乙醇体积分数为60%、超声时间为40 min、超声温度为40 ℃、超声功率为70 W时，总黄酮最高得率为1.851%。
[参考文献]
[1]宋正达，朱洪武，陈梅香.景天科多肉胧月在立体绿化中的应用研究[J].绿色科技，2015（3）：90-91.
[2]刘一杰，薛永常.植物黄酮类化合物的研究进展[J].中国生物工程杂志，2016，36（9）：81-86.
[3]李萌茹，周玉枝，杜冠华，等.中药黄酮类化合物抗衰老作用及其机制研究进展[J].药学学报，2019，54（8）：1382-1391.
[4]付煜荣，姚荣章.景天三七中总黄酮提取条件和含量分析[J].河北北方学院学报（医学版），2010，27（1）：13-15.
[5]李珊，雷富平.红景天黄酮类化合物提取及药理活性研究进展[J].饮料工业，2016，19（6）：57-59.
[6]田淑雨，鹿士峰，吴杨洋，等.超声破碎辅助提取灵芝多糖工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品研究与开发，2019，40（8）：101-107.