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摘要： 研发了一套基于连续扫描的激光共焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscopy，LCSM）系统。该系统采用工作台连续运动方式实现扫描，提出了利用单次采集的数据滤除随机噪声的方法，避免了多帧取平均对成像速度造成的影响。实现连续扫描的关键在于解决工作台运动与数据采集的同步问题，利用采集卡有限采集模式，合理匹配工作台参数和采集参数，成功解决了这一问题。详细介绍了影响分辨率的因素，通过合理选取探测器针孔直径，取样间隔，确保了实现高分辨率的要求。系统利用Visual C#开发的控制平台，成功地对生物细胞进行了扫描成像。实验结果表明：基于连续扫描的LCSM具有较高的分辨率，生成的显微图像没有任何畸变，并且成像速度有了大幅度提高。
关键词：
显微镜； 扫描； 采集； 同步； 随机噪声
中图分类号： O 436文献标识码： Adoi： 10.3969/j.issn.10055630.2013.05.014
引言
激光共焦扫描显微镜（LCSM）广泛应用在生物医学和材料科学等领域[1]，因其具有三维成像能力和良好的横向分辨率和纵向分辨率[24]受到了广泛的关注。传统的扫描共焦显微镜，一般采用光束扫描式[5]，利用两个相互垂直的平面扫描振镜实现光学切片二维扫描[6]；然而，对于超大视场的成像，光束扫描方式由于在扫描过程中使光束发生偏转，会在视场边缘产生球差，引起视场边缘成像与中心成像分辨率的不一致，从而容易导致光斑的空间轮廓形状凹凸不平[7]。近年来，提出了一种采用数字微镜器件的并行共焦检测系统[810]提高成像速度的方法，但是在微透镜阵列焦平面上得到的焦点是非均匀分布的，产生了一些畸变，与理想的焦点发生了位移。因此，采用工作台运动实现扫描，即激发光的会聚焦点静止而载物台进行二维或三维运动实现连续扫描。这种工作台运动扫描方式，优点是在对超大视场的逐点扫描成像时，可以在整个视场区域实现一致的高分辨率成像，缺点则是成像速度慢。
为了提高成像速度，本文对工作台运动扫描方式LCSM中传统的多帧取平均的方法进行了改进，设计并实现了一种基于工作台连续运动的LCSM系统，并且提出了单帧成像滤除随机噪声的方法。
1反射式LCSM的工作原理
图1是设计的反射式LCSM系统原理图，该系统主要由几大模块组成，包括：光学成像模块、光电转换及放大模块、机械扫描模块、数据采集及数据处理模块。
其中光学成像模块采用无限远光学系统，由于其系统中存在一段平行光路，在光学结构设计和像差矫正上具有一定的优势。入射光波为405 nm的激光，该波长不仅不会杀伤细胞，而且满足高分辨率的要求。采用共轭技术成像，使光源、被测样品及探测器处于彼此对应的共轭位置上。入射激光经过分光镜反射后聚焦到样品的某点处，由该点激发出来的荧光透过显微物镜，光束经过分光镜与高通滤波器后，仅有荧光波段通过，荧光通过成像透镜聚焦于针孔处，非焦平面上的杂散光被滤掉，通过针孔的荧光被光电倍增管接收，工作台通过作三维扫描便可以完成对光学断层成像。
2影响LCSM分辨率的因素
2.1针孔大小及取样间隔的选择
针孔的大小与爱里斑的直径相关，许多人对LCSM的三维光学传递函数与探测器前方针孔直径之间的关系进行了研究[1112]。结果表明[11]，该针孔直径不必非常小。当针孔直径恰好等于一个爱里斑所成像的大小时，探测器接收到的光能量较高，既可以提高信噪比，又不会对分辨率造成特别大的影响。爱里斑经过无限远光学系统放大后，其像的大小为：
其中，β为系统的放大倍率，λ为入射光波长，NA为数值孔径。已知β=40倍，λ=405 nm，NA=0.95，根据式（1）计算得到爱里斑像的大小约为20 μm。因此，该系统选用20 μm针孔直径。取样间隔遵循的原理是奈奎斯特采样定理，将爱里斑作为周期信号，能够区分两个爱里斑的取样间隔为0.25个爱里斑直径，将取样间隔定位在100～125 nm之间，即可满足还原高分辨率图像的要求。
2.2数据分配消除随机噪声
随机噪声具有很宽的频谱，若采用低通滤波，必然会造成图像的高频成分损失。传统的做法是多帧平均，根据随机噪声互不相关的特点，且均值为零，可以有效的压缩噪声。具体的方法就是在被测实验样本荧光极弱的情况下可通过多帧平均的方法来提高信噪比。尽管纳米位移台的重复精度很高（小于5 nm），但是多帧平均会使扫描时间成倍增加，为了在一次扫描时间内完成滤除随机噪声的任务，提出了利用数据分配滤除随机噪声的方法，即在每一点附近采集多次，再将这些值累加或加权取平均得到该点的能量值。具体原理如下所述。
在任意时刻采集的数据为：
累加后的信噪比提高了K倍。
采集卡的型号是NI6120（12 bit），采样率单位为S/s，表示每秒钟采集的次数。最高采样率可以达到10 000 000 S/s。当采样率足够高时，可以近似认为在一点处取得的平均值，就每一行而言，具体采集方法如图2所示。
若采集范围为50 μm，需要500个像素，工作台扫描速度为100 μm/s，当采样率设置为1 000 000 S/s时，每行可以得到500 000个点，取样间隔为100 nm，每个间隔内有1 000个采集点可供分配，若将1 000个采集点都取平均，相当于低通滤波器掩膜尺寸太大，导致细节被滤掉，图像变得很平滑。为了避免这种情况，只取其中的前十分之一的数据，即100个采集点做加权平均，这100个采集点分布在10 nm范围内，对分辨率不会造成影响。 如图3所示，两幅图均取了50次平均，图3（a）的采样率为10 000 S/s；图3（b）的采样率为100 000 S/s可以看出随着采样率的提高，平滑效果减弱。事实上，当采样率可以设置为10 000 000 S/s时，取样平均的次数也可以增加，使均值趋于零。利用这种方法有效地滤掉了随机噪声，同时还保留了图像细节。
3同步系统设计
3.1同步采集方法研究
该系统选用PI公司的3轴压电陶瓷驱动纳米位移台，型号是P545，3个轴移动范围均为200 μm，由于具有长量程和型面不高的特点，非常容易整合进高分辨率的显微镜内，并且位移精度可以达到1 nm，完全满足高分辨成像的需要。
连续扫描是指工作台可以从初始位置连续移动到目标位置，同时采集卡不间断的采集数据，因此，工作台与采集卡实现同步尤为重要。工作台P545的单向重复性优于双向。因此，采用如图4所示的单向梳状扫描路径，并以100 μm/s的速度运动的，在这个速度下运动，工作台状态比较稳定。
采集卡需要工作在有限连续采集模式下，具体方法：给每一行分配一个指定大小的缓存区，当工作台运动到每一行的目标位置时，恰好使采集到的数据填满缓存区，读取后清空缓存区；工作台沿纵向只移动步距，不采集数据。每行采集均重复此过程，采集卡在该模式下工作，没有任何数据被覆盖掉。除此之外，为了实现工作台运动与数据采集同步，还需将工作台与采集卡参数匹配设置，表1列举了一些工作台与采集卡设置的参数，根据不同的需求，选择合适的扫描范围。其中，扫描范围、扫描速度与像素数目决定了成像时间，扫描范围与像素数目决定了取样间隔，继而影响了分辨率，表1给出的参数满足实现高分辨率成像的要求。根据实际情况对分辨率的不同要求，调整表中的参数，在相同扫描范围与像素数目下，采样率越高，赋值范围越小，去噪效果越好。
3.2系统软件设计
为数据同步采集模块的软件设计流程图。首先，设置工作台扫描速度与扫描范围；然后，设置采样率，使采样率、扫描速度和扫描范围完全匹配，即保证工作台运动到目标位置时，采集卡缓存区刚好被填满，其中，循环次数由像素数决定。
操作控制界面如图6所示，主要包括光源控制模块、采集参数设置、工作台控制器参数设置、实时显示模块。
4实验结果
本文所研究的显微镜实验装置如图7所示，鉴于稳定性的要求，加工了三维支架，保证了绝对水平和垂直。为了方便寻找细胞，将分光镜分离的另一束光成像在CCD上，并且在工作台下方安装了粗调X，Y两个方向的底座。
实验中所采用的样品是老鼠脑细胞，细胞的平均尺寸约为10 μm。将表1中的参数输入软件中，完成图像扫描，可获得如图8（b）所示的共焦扫描图像，并与蔡司宽场显微镜对该细胞拍摄的图像进行对比，如
5结论
本文研制的基于工作台连续运动的LCSM系统，完成了系统控制和数据采集的任务，利用有限连续采集模式，解决了机械控制与数据采集难以同步的问题，并在此基础上完成了软件系统的开发工作。与传统的多帧取平均扫描方式相比，大大地提高了成像速度。本文所述的实验结果是在纳米位移台单向扫描方式下获得的，若纳米位移台双向重复性好，能够实现双向扫描，还可以进一步提高成像速度。
参考文献：
[1]于彦华，邢达.激光共焦扫描显微镜及其在生物学上的应用[J].激光杂志，1999，20（6）：35-38.
[2]SHEPPARD C J R，WILSON T.Depth of field in the scanning microscope[J].Opt Lett，1978，3（3）：115-117.
[3]STREIBL N.Threedimensional imaging by a microscope[J].Opt Soc Am，A，1985，2（2）：121-127.
[4]BERTERO B，ME C D，PIKE R.Analytic inversion formula for confocal scanning microscopy[J].Opt Soc Am A，1987，4（9）：1748-1750.
[5]张运波，侯文玫，句爱松.基于数字微镜器件的共焦显微镜的设计与实验[J].仪器仪表学报，2011，32（9）：2109-2113.
[6]CARLSSON K.Scanning and detection techniques used in a confocal scanning laser microscope[J].Journal of Microscopy，1990，157（1）：21-27.
[7]周拥军，陈德强，黄浩文，等.共聚焦激光扫描显微镜扫描系统研制[J].光学 精密工程，2002，10（6）：582-587.
[8]缪洪波，胡翔宇，周瑛，等.二维扫描共焦显微镜的研究[J].光学仪器，2003，25（1）：38-44.
[9]LIANG M，STEHR R L，KRAUSE A W.Confocal pattern period n multipleaperture confocal imaging systems with coherent illumination[J].Optics Letters，1997，22（11）：751-753.
[10]JIANG S H，WALKER J.Differential highspeed digital micromirror device based fluorescence speckle confocal microscopy[J].Applied Optics，2010，49（3）：497-504.
[11]KAWATA S，ARIMOTO R，NAKAMURA O.Threedimensional opticaltransferfunction analysis for a laserscan fluorescence microscope[J].Opt Soc Am，1991，8（1）：171-175.
[12]WILSON T，CANLINI A R.Size of the detector in confocal imaging systems[J].Optics Letters，1987，12（4）：227-229.
关键词：
显微镜； 扫描； 采集； 同步； 随机噪声
中图分类号： O 436文献标识码： Adoi： 10.3969/j.issn.10055630.2013.05.014
引言
激光共焦扫描显微镜（LCSM）广泛应用在生物医学和材料科学等领域[1]，因其具有三维成像能力和良好的横向分辨率和纵向分辨率[24]受到了广泛的关注。传统的扫描共焦显微镜，一般采用光束扫描式[5]，利用两个相互垂直的平面扫描振镜实现光学切片二维扫描[6]；然而，对于超大视场的成像，光束扫描方式由于在扫描过程中使光束发生偏转，会在视场边缘产生球差，引起视场边缘成像与中心成像分辨率的不一致，从而容易导致光斑的空间轮廓形状凹凸不平[7]。近年来，提出了一种采用数字微镜器件的并行共焦检测系统[810]提高成像速度的方法，但是在微透镜阵列焦平面上得到的焦点是非均匀分布的，产生了一些畸变，与理想的焦点发生了位移。因此，采用工作台运动实现扫描，即激发光的会聚焦点静止而载物台进行二维或三维运动实现连续扫描。这种工作台运动扫描方式，优点是在对超大视场的逐点扫描成像时，可以在整个视场区域实现一致的高分辨率成像，缺点则是成像速度慢。
为了提高成像速度，本文对工作台运动扫描方式LCSM中传统的多帧取平均的方法进行了改进，设计并实现了一种基于工作台连续运动的LCSM系统，并且提出了单帧成像滤除随机噪声的方法。
1反射式LCSM的工作原理
图1是设计的反射式LCSM系统原理图，该系统主要由几大模块组成，包括：光学成像模块、光电转换及放大模块、机械扫描模块、数据采集及数据处理模块。
其中光学成像模块采用无限远光学系统，由于其系统中存在一段平行光路，在光学结构设计和像差矫正上具有一定的优势。入射光波为405 nm的激光，该波长不仅不会杀伤细胞，而且满足高分辨率的要求。采用共轭技术成像，使光源、被测样品及探测器处于彼此对应的共轭位置上。入射激光经过分光镜反射后聚焦到样品的某点处，由该点激发出来的荧光透过显微物镜，光束经过分光镜与高通滤波器后，仅有荧光波段通过，荧光通过成像透镜聚焦于针孔处，非焦平面上的杂散光被滤掉，通过针孔的荧光被光电倍增管接收，工作台通过作三维扫描便可以完成对光学断层成像。
2影响LCSM分辨率的因素
2.1针孔大小及取样间隔的选择
针孔的大小与爱里斑的直径相关，许多人对LCSM的三维光学传递函数与探测器前方针孔直径之间的关系进行了研究[1112]。结果表明[11]，该针孔直径不必非常小。当针孔直径恰好等于一个爱里斑所成像的大小时，探测器接收到的光能量较高，既可以提高信噪比，又不会对分辨率造成特别大的影响。爱里斑经过无限远光学系统放大后，其像的大小为：
其中，β为系统的放大倍率，λ为入射光波长，NA为数值孔径。已知β=40倍，λ=405 nm，NA=0.95，根据式（1）计算得到爱里斑像的大小约为20 μm。因此，该系统选用20 μm针孔直径。取样间隔遵循的原理是奈奎斯特采样定理，将爱里斑作为周期信号，能够区分两个爱里斑的取样间隔为0.25个爱里斑直径，将取样间隔定位在100～125 nm之间，即可满足还原高分辨率图像的要求。
2.2数据分配消除随机噪声
随机噪声具有很宽的频谱，若采用低通滤波，必然会造成图像的高频成分损失。传统的做法是多帧平均，根据随机噪声互不相关的特点，且均值为零，可以有效的压缩噪声。具体的方法就是在被测实验样本荧光极弱的情况下可通过多帧平均的方法来提高信噪比。尽管纳米位移台的重复精度很高（小于5 nm），但是多帧平均会使扫描时间成倍增加，为了在一次扫描时间内完成滤除随机噪声的任务，提出了利用数据分配滤除随机噪声的方法，即在每一点附近采集多次，再将这些值累加或加权取平均得到该点的能量值。具体原理如下所述。
在任意时刻采集的数据为：
累加后的信噪比提高了K倍。
采集卡的型号是NI6120（12 bit），采样率单位为S/s，表示每秒钟采集的次数。最高采样率可以达到10 000 000 S/s。当采样率足够高时，可以近似认为在一点处取得的平均值，就每一行而言，具体采集方法如图2所示。
若采集范围为50 μm，需要500个像素，工作台扫描速度为100 μm/s，当采样率设置为1 000 000 S/s时，每行可以得到500 000个点，取样间隔为100 nm，每个间隔内有1 000个采集点可供分配，若将1 000个采集点都取平均，相当于低通滤波器掩膜尺寸太大，导致细节被滤掉，图像变得很平滑。为了避免这种情况，只取其中的前十分之一的数据，即100个采集点做加权平均，这100个采集点分布在10 nm范围内，对分辨率不会造成影响。 如图3所示，两幅图均取了50次平均，图3（a）的采样率为10 000 S/s；图3（b）的采样率为100 000 S/s可以看出随着采样率的提高，平滑效果减弱。事实上，当采样率可以设置为10 000 000 S/s时，取样平均的次数也可以增加，使均值趋于零。利用这种方法有效地滤掉了随机噪声，同时还保留了图像细节。
3同步系统设计
3.1同步采集方法研究
该系统选用PI公司的3轴压电陶瓷驱动纳米位移台，型号是P545，3个轴移动范围均为200 μm，由于具有长量程和型面不高的特点，非常容易整合进高分辨率的显微镜内，并且位移精度可以达到1 nm，完全满足高分辨成像的需要。
连续扫描是指工作台可以从初始位置连续移动到目标位置，同时采集卡不间断的采集数据，因此，工作台与采集卡实现同步尤为重要。工作台P545的单向重复性优于双向。因此，采用如图4所示的单向梳状扫描路径，并以100 μm/s的速度运动的，在这个速度下运动，工作台状态比较稳定。
采集卡需要工作在有限连续采集模式下，具体方法：给每一行分配一个指定大小的缓存区，当工作台运动到每一行的目标位置时，恰好使采集到的数据填满缓存区，读取后清空缓存区；工作台沿纵向只移动步距，不采集数据。每行采集均重复此过程，采集卡在该模式下工作，没有任何数据被覆盖掉。除此之外，为了实现工作台运动与数据采集同步，还需将工作台与采集卡参数匹配设置，表1列举了一些工作台与采集卡设置的参数，根据不同的需求，选择合适的扫描范围。其中，扫描范围、扫描速度与像素数目决定了成像时间，扫描范围与像素数目决定了取样间隔，继而影响了分辨率，表1给出的参数满足实现高分辨率成像的要求。根据实际情况对分辨率的不同要求，调整表中的参数，在相同扫描范围与像素数目下，采样率越高，赋值范围越小，去噪效果越好。
3.2系统软件设计
为数据同步采集模块的软件设计流程图。首先，设置工作台扫描速度与扫描范围；然后，设置采样率，使采样率、扫描速度和扫描范围完全匹配，即保证工作台运动到目标位置时，采集卡缓存区刚好被填满，其中，循环次数由像素数决定。
操作控制界面如图6所示，主要包括光源控制模块、采集参数设置、工作台控制器参数设置、实时显示模块。
4实验结果
本文所研究的显微镜实验装置如图7所示，鉴于稳定性的要求，加工了三维支架，保证了绝对水平和垂直。为了方便寻找细胞，将分光镜分离的另一束光成像在CCD上，并且在工作台下方安装了粗调X，Y两个方向的底座。
实验中所采用的样品是老鼠脑细胞，细胞的平均尺寸约为10 μm。将表1中的参数输入软件中，完成图像扫描，可获得如图8（b）所示的共焦扫描图像，并与蔡司宽场显微镜对该细胞拍摄的图像进行对比，如
5结论
本文研制的基于工作台连续运动的LCSM系统，完成了系统控制和数据采集的任务，利用有限连续采集模式，解决了机械控制与数据采集难以同步的问题，并在此基础上完成了软件系统的开发工作。与传统的多帧取平均扫描方式相比，大大地提高了成像速度。本文所述的实验结果是在纳米位移台单向扫描方式下获得的，若纳米位移台双向重复性好，能够实现双向扫描，还可以进一步提高成像速度。
参考文献：
[1]于彦华，邢达.激光共焦扫描显微镜及其在生物学上的应用[J].激光杂志，1999，20（6）：35-38.
[2]SHEPPARD C J R，WILSON T.Depth of field in the scanning microscope[J].Opt Lett，1978，3（3）：115-117.
[3]STREIBL N.Threedimensional imaging by a microscope[J].Opt Soc Am，A，1985，2（2）：121-127.
[4]BERTERO B，ME C D，PIKE R.Analytic inversion formula for confocal scanning microscopy[J].Opt Soc Am A，1987，4（9）：1748-1750.
[5]张运波，侯文玫，句爱松.基于数字微镜器件的共焦显微镜的设计与实验[J].仪器仪表学报，2011，32（9）：2109-2113.
[6]CARLSSON K.Scanning and detection techniques used in a confocal scanning laser microscope[J].Journal of Microscopy，1990，157（1）：21-27.
[7]周拥军，陈德强，黄浩文，等.共聚焦激光扫描显微镜扫描系统研制[J].光学 精密工程，2002，10（6）：582-587.
[8]缪洪波，胡翔宇，周瑛，等.二维扫描共焦显微镜的研究[J].光学仪器，2003，25（1）：38-44.
[9]LIANG M，STEHR R L，KRAUSE A W.Confocal pattern period n multipleaperture confocal imaging systems with coherent illumination[J].Optics Letters，1997，22（11）：751-753.
[10]JIANG S H，WALKER J.Differential highspeed digital micromirror device based fluorescence speckle confocal microscopy[J].Applied Optics，2010，49（3）：497-504.
[11]KAWATA S，ARIMOTO R，NAKAMURA O.Threedimensional opticaltransferfunction analysis for a laserscan fluorescence microscope[J].Opt Soc Am，1991，8（1）：171-175.
[12]WILSON T，CANLINI A R.Size of the detector in confocal imaging systems[J].Optics Letters，1987，12（4）：227-229.